# Az élet mozijának megállítása: hogyan lehet egy biológiai mintát rögzíteni?

Az agy szerkezetvizsgálatának egy fontos lépése kimaradt az #agytechnikák rovatból. Ráadásul az első. Írtunk a festésekről a mikroszkopizálásról, de arról nem hogyan jutunk hozzá a biológiai mintákhoz.

Ennek módja pedig nagyon nem lényegtelen!
Egy biológiai rendszer, egy élőlény, annak szövetei, és azok sejtjei, hihetetlen mennyiségű kölcsönható molekulából állnak. Egy sejtet úgy kell elképzelni, mint egy több millió bonyolult, bár apró gépből álló gyárat, mely gépek több milliárd alkatrészének térben és időben nagyon pontosan kell összekapcsolódnia ahhoz, hogy a sejt, az élet működjön.

Ha vizsgálni akarjuk mi történik egy sejtben, esetünkben idegsejtben, akkor ezt az élő rendszert minél pontosabban kell a vizsgálatra alkalmas állapotban megtartani. Nyilván a legegyszerűbb, ha életben tartjuk. De ez nem mindig lehetséges, mert pl. egy patkány nemigen fér be egy elektronmikroszkópba. Azaz kisebb darabokat kell olyan állapotba hozni, hogy szerkezetük megmaradjon az élőhöz minél hasonlóbb állapotban.

A gond ott van, hogy amikor egy szövetdarabot eltávolítunk megszűnik annak vérkeringése, lehűl és egyéb dolgok történnek vele. Amikor megszűnik egy sejt oxigén- és tápanyag-ellátása, azt az energia termelését végző mitokondriumok a másodperc tört része alatt megérzik. Sejthártyájukon nem áramlanak többé a protonok és megáll az ATP termelés. Egy sejt számára ez az egyik alapvető jel a programozott sejthalál, az apoptózis beindítására. Ez egy aktív öngyilkosság, egy folyamat, mely az eukarióták (valódi sejtmagvasok, mint mi is) 2 milliárd évesegy evolúciója során alakult ki és a szervezet jól összehangolt működésének biztosításához szükséges. Ez akkor hasznos, ha csak egyes sejtekkel van baj (vírusfertőzés, daganatsejt, hősokk, stb. esetén), de nyilván ha minden sejtet érint akkor nem előnyös, de hát ilyenkor már úgyis mindegy az élőlény szempontjából. De nem a kutató szempontjából.
Ugyanis a sejthalál során rengeteg fehérjebontó enzim szabadul fel, pillanatok alatt, hogy a sejt molekuláris gépeit lebontsa. Normál esetben ez arra való, hogy a sejt ilyenkor felszabaduló alapanyagait más, egészséges sejtek felhasználhassák. Azaz, ha minimális mértékben is teketóriázunk, működő sejt helyett egy romhalmazt tudunk csak vizsgálni. A biológus problémája tehát az, hogy hogyan lehet egy élő sejtből mihamarabb egy NAGYON halott (nem haldokló), egyáltalán nem működő, rögzített szerkezetű sejtet kapni.

A megoldásra számos próbálkozás született. Amit a (neuro)anatómusok legrégebb óta használnak (nem szükségszerűen a legjobb megoldás) az a szövetek aldehidekkel való rögzítése, a fixálás. Ki nem látott még anatómia múzeumokban formaldehidben úszó végtagokat, embriókat, brrr.

Az aldehidek (formaldehid és paraformaldehid) a fehérjék lizin aminosavához vagy a fehérjék peptidkötéseiben levő -NH- csoport hidrogénjéhez kötnek, hidroxi-metil csoportot, majd ezek összekapcsolódás után metilén hidat képezve. Röviden, keresztkötésekkel rögzítik a fehérjéket, magukon belül és egymás közt. Olyan ez, mintha a finom molekuláris gépekbe finom molekuláris csavarkulcsokat dobálnánk vagy leöntenénk molekuláris betonnal. Minden befagy, lemerevedik, megállnak a folyamatok. A fixálás előtti agy egy rózsaszín pudingszerű, mállékony anyag, mely a fixálás után egy fehéres-szürkés gumiradír állagú, ha leesik felpattan anyaggá változik. Ez két szempontból jó. Egyrészt fixált, azaz lehet az eredeti állapotot vizsgálni, másrészt keményebb ellenállóbb lesz, lehet belőle például a festésekhez és mikroszkópos vizsgálatokhoz szükséges vékony (40-90 µm-es) metszeteket vágni az erre a célra szolgáló mikrotóm nevű szerkezeten.

Ezzel a megközelítéssel az a baj, hogy ha egy szövetdarabot beledobok aldehidbe akkor az csak diffúzióval jut be a szövetbe, és később ér oda, mint hogy az oxigén elfogy és beindul a sejtpusztító apoptózis. Megoldásnak azt találták ki az anatómusok, hogy elaltatják kísérleti állatukat, majd a szíven keresztül a vérkeringésbe juttatják az aldehideket, melyek a legfinomabb hajszálereken (kapillárisokon) keresztül eljutnak a szervezet minden sejtjéhez. Ezzel a módszerrel 2-3 percre lehet lerövidíteni az átmeneti időt.

Ez jobb, mint a semmi, de sokszor nem elég gyors. Valami olyan módszert kell kitalálni, ami egyszerre egész térfogatában állítja meg a folyamatokat. Erre két irány van, vagy nagyon gyorsan hűteni, vagy nagyon gyorsan melegíteni kell a mintát. A gyors hűtés jégbe fagyasztja a rendszert, azaz minden a helyén marad, leállnak a kémiai folyamatok. A gyors melegítés pedig denaturálja a fehérjéket, működésképtelen alakba (konformációba) csapja ki őket. Értelemszerűen ez nem feltétlenül jó mindig, pl. amikor antitestekkel akarunk immunfestést végezni, hiszen azok a fehérjét szerkezete alapján azonosítják, és ha ez megváltozott akkor nem járunk sikerrel.

Persze a hűtés / melegítés esetében is fennál az a gond, mint ami az aldehidek esetében. Ahogy az aldehidek lassan diffundálnak a hőterjedés is véges sebességű. A melegítés esetében kisebb a gond, mert mikrohullámot használva az anyag belseje is melegíthető. Azaz egy anatómus laborban találhatók erre a célra használt mikrohullámú sütők, amikbe az aldehidben úszó mintákat melegítik a gyorsabb és alaposabb fixálás eléréséhez.

A gyors hűtéshez is kidolgoztak ravasz rendszereket. Az ingerületátvívő anyagok felszabadulásának lépéseit vizsgáló agykutatók hekkeltek egy speciális szerkentyűt, mely az agyból hihetetlen gyorsan kicsippent egy darabot, majd folyékony héliumba mártott rézlapok közé zárja. A folyékony hélium fura kvantum tulajdonságai miatt a legjobb hővezető anyag, ezért nagyon hatékonyan hűt. De persze még így is csak fél milliméter méretű anyagdarabokat tudnak kellően gyorsan áthűteni. Ezzel a módszerrel sikerült elektron mikroszkópos felvételt készíteni arról a pillanatról amikor egy ingerületátvívő anyagot felszabadító hólyagocska (vezikula) éppen beleolvad az axonvégződés sejthártyájába és a szinaptikus résbe önti tartalmát. Volt olyan kísérlet is (én egy kicsit elkeseredett próbálkozásnak nevezném), ahol egy egeret hosszú ideig treníroztak arra, hogy egy tanulási feladat végén ugorjon be egy lukba. Amikor ez már jól ment a luk túloldalára egy folyékony nitrogénnel teli tartályt tette. Ebbe érkezett az egér…. a cél az volt, hogy elcsípjék mi történik az egér agyában tanulás közben. Arra már nem emlékszem ez mennyire volt sikeres megközelítés, de a tényből, hogy kevesen használjak ezt a módszert, úgy tűnik nem volt sikeres, vagy csak az állatetika bizottság nem ad ilyenre engedélyt.

A fixálást, vagy rögtön vagy az anatómiai festések elvégzése után, követi egy fontos lépés, melynek során a minta víztartalmát (vagy fagyaszott minta esetében jégtartalmát) több lépésben műgyantára cserélik (régen paraffinba ágyazták a metszeteket). Ennek célja, egyrészt, a minta gyakorlatilag örök életre való megőrzése, másrészt keményítése, hogy az elektron mikroszkópiához szükséges 30-70 nm (a fény hullámhosszával összemérhető) vagy a fénymikroszkópiához szökséges 20-40 mikrométer vastag metszeteket lehessen készíteni. A harmadik cél a minta átlátszóvá tétele, hogy fénymikroszkópban jól vizsgálható legyen.

Összefoglalva: A fixálás lényege, hogy az élő rendszert mielőbb hozzuk a vizsgálatra alkalmas, tartósan rögzített állapotba.

Szerző: Gulyás Attila

Adattárak, közösségi tudomány, állampolgár kutatók MikroProject tervezés és felkészülés: fizsó, puffer, fixáló, jegyzőkönyv