# Molekuláris-genetikai módszerek az agykutatásban: Bevezető

Az #agytecnikák rovatban, meglehetősen régen, körbejártuk az anatómia és fiziológia módszereit. Itt az ideje, hogy a molekuláris/genetikai módszereket is bemutassam. Jó nagy falat. A régi, klasszikus technikáktól indulok, és eljutok a legmodernebb, 2020–2025 között megjelent eljárásokig. Hatalmas a fejlődés, számos régi anatómiai és elektrofiziológiai módszert is leváltanak már ezek a technikák. Először egy kicsit ámokfutás szerű lajstrom következik a technikákról, majd részletesebben is elmerülünk a fontosabb módszerek működésében és lehetőségeiben.

Kezdjük azzal, hogy miért is van szükség molekuláris-genetikai technikákra, mire is használjuk őket, mit tudhatunk meg segítségükkel.

Az idegrendszer idegsejtekből és gliasejtekből áll. Lévén sejtek, a bennük lévő DNS információ tartalma határozza meg működésüket. A kisebb-nagyobb, sejtosztódáskor bekövetkező másolódási hibákból eredő, mutációkat leszámítva, minden egyes sejtünkben ugyanazt az infomációt hordozza DNS-ünk. Mégis szervezetünkben rengeteg eltérő működésű sejttípus alkot különböző szöveteket.
Akkor most ez hogy is van? Ugyanaz az információ, mégis más a működés?

A megoldás az, hogy a sejtekben nem csak genetika, hanem epigenetika is működik. Azt hogy egy sejtben milyen gének lesznek bekapcsolva a genetikus és epigenetikus faktorok együtt határozzák meg.

Amikor egyetemre jártam (régen), akkor azt tanultuk, hogy a biológia centrális dogmája ez:

DNS-->RNS-->fehérje

Azaz, a DNS-ről a transzkripció során mRNS keletkezik, amiről a transzláció során fehérjék készülnek. No ez az elképzelés időközben rengeteg extra szabályozással és csavarral gazdagodott.
Kezdetben úgy gondoltuk a minden sejtünkben ugyanazt az információt hordozó DNS különböző szakaszairól csak akkor íródik át információ, ha az adott szakaszok (gének) szabályozó régióihoz a megfelelő transzkripciós faktorok kötődnek vagy nem kötődnek (mert hogy van pozitív meg negatív szabályozás is). Aztán kiderült hogy vannk epigenetikai mechanizmusok is, melyek olyan sejten belüli szabályozások, amelyek nem változtatják meg a DNS szekvenciáját, mégis tartósan befolyásolják, hogy mely gének aktívak és melyek hallgatnak. Ide tartozik a DNS-metiláció, amely kémiai jelölésekkel „lezárhat” génszakaszokat, valamint a hisztonmódosítások, amelyek meghatározzák, mennyire hozzáférhető a DNS a leolvasó fehérjék számára. Fontos szerepet játszanak a kromatin szerkezeti átrendeződései is: a DNS térbeli csomagolása eldönti, hogy egy gén fizikailag elérhető-e az átíráshoz. Emellett különböző nem-kódoló RNS-ek is képesek finoman szabályozni a génkifejeződést azáltal, hogy gátolják vagy irányítják az RNS-ek sorsát. Ezek az epigenetikai jelölések információt hordoznak a sejt múltjáról – például fejlődési döntésekről, környezeti hatásokról vagy stresszről –, és sejtosztódáskor részben továbböröklődnek, így stabil sejtazonosságot biztosítanak.
Egy sejt működését, funkcióját, tehát az határozza meg, hogy citoplazmájában, de leginkább sejtmagjában milyen transzkripciós faktorok vannak, hanem hogy milyen volt korábbi sorsa, milyen ingerek érték.
Kicsit olyan, mint egy szakácskönyv és a szakács által benne hagyott cetlik és jegyzetek, valamint a spájz tartalma közötti összefüggés az ebéd meghatározásában. Sok háztartásban meglehet ugyanaz a szakácskönyv, ugyanazokkal a receptekkel, de az egyik helyen a Narancsos kacsa és Gyömbéres körtés nyúlgerinc mellett vannak a szamárfülek, meg a saját változatokat leíró jegyzetek, a másik családban pedig a Pacalpörkölt és a Vesevelő mellett. És ehhez jön még, hogy a spájzban miből válogathatunk az ebéd elkészítéséhez.

Amikor egy sejt osztódik leánysejtjeinek átadja transzkripciós faktorait és epigenetikusan módosított genomját, mint ahogy a nagymama a szakácskönyvet az unokájának a saját jegyzeteivel. Osztódáskor a faktorok átadása gyakran aszimmetrikus, azaz a két leánysejt más faktorokat visz magával és emiatt szakosodik (specializálódik) más feladatok megoldására. A leánysejtekben ezért eltérő DNS szakaszokról íródnak át mRNS-ek, melyek aztán eltérő feladatú fehérjék íródnak át. Ezek egy része valamilyen anyagcserében, vagy sejtalkotó részek felépítésében szerepet játszó fehérje, más részük transzkripciós faktor.
Ha egy sejt működését akarjuk megérteni, akkor nem DNS-ét, hanem a sejtekben az adott állapotban található fehérjéket kell megvizsgálnunk. A fehérjék azonosítása azonban nem egy egyszerű feladat (erről szól a proteomika). Ennél sokkal egyszerűbb a sejtben az adott pillanatban átíródó fehérjéket kódoló mRNS-ek vizsgálata, ezért ezt is teszik a kutatók. Ennek oka, egyrészt, hogy míg a fehérjékben 24 aminosav van, addig az RNS-ben csak 4 bázispár (könnyebb az alkotóelem sorozat meghatározása), a másik, hogy a DNS és RNS molekulák funkciójukból (és felépítésükből) fakadóan (információ másolás és továbbítás) könnyen sokszorosíthatók és ezáltal az egyes sejtekből kinyerhető nagyon kevés mennyiségű fehérjénél könnyebb dolgozni a kevés mennyiségű, később megsokszorozott RNS mintákkal. De mint láttuk nem csak az mRNS készlet befolyásolja milyen fehérjék kellenek, hanem az epigenetikus faktorok is.
A nagy előrelépés ami az elmút 5 évben történt, hogy a legújabb módszerek az összes szabályozó elem, akár együttes, vizsgálatára alkalmasak .

Az ámokfutást a Klasszikus módszerek lajstromozásával kezdjük:

## Klasszikus (több évtizede használt módszerek)

analitikus és manipulatív módszerek:

a) a DNS vizsgálatával megmutatják hogy az adott sejt vagy szövet milyen genetika információt hordoz, vannak-e mutációk;

b) az átírt RNS vizsgálatával az aktuális működést és szabályozást vizsgálják (milyen gének vannak bekapcsolva és hol);

c) a fehérjék elemzésével pedig megnézik valóban mi történik az egyes sejtekben, szövetekben.;

d) genetikai módosításokkal ki-be kapcsolnak géneket, reporter (jelző) géneket használnak, melyek megmutatják hol és mikor kapcsol be egy gén és annak mi a hatása.

I. Molekuláris analitikus módszerek:
1. PCR és qPCR: RNS alapú, génexpresszió mennyiségi mérésére, splice variánsok, mutációk kimutatására alkalmas
2. In situ hibridizáció (ISH): RNS lokalizációja szövetben, neuron- és gliasejt-típusok meghatározása
3. Southern és Northern blot: ma már ritkább, de alapvető eljárások génvariációk (DNS) és kifejezett RNS-analíziséhez
4. Western blot: fehérjék kimutatása, foszforiláció és más módosítások elemzése
II. Génexpresszió és fehérjeexpresszió manipulálása:

megváltoztatják a gének kifejeződését, ki-be kapcsolható gének, illetve létrehozhatók új géneket kifejező sejtek, élőlények, ezek lehetnek csak jelző (reporter) gének, fehérjék, de funkciót is megváltoztathatnak vagy betegségmodellként használhatók.
5. Expressziós technikák: génbeültetés plazmidokkal, promóter analízis, reportergének (GFP, LacZ)
6. Transzgénikus állatok (régi módszer, de aktív): random integráció, neuron-specifikus promóterek (CamKII, Synapsin)
7. Knock-out és knock-in modellek (pre-CRISPR): homolog rekombinációval ES sejtekben, időigényes, de ma is létező megközelítés bizonyos célokra
8. RNA interference – siRNA, shRNA: géncsendesítés sejtkultúrában és in vivo, vírusvektorral vagy elektroporációval
9. Antisense oligonukleotidok (ASO-k): specifikus génlehallgatás, klinikumban is (SMA kezelés)

A következő bejegyzésben az utóbbi 5 évben kifejlesztett, szerintem lenyűgöző trükköket alkalmazó módszerek listázását folytatjuk.

Szerző: Gulyás Attila

Hova földelünk, mikor agyi jeleket mérünk? 2015-2025 között fejlesztett molekuláris genetikai módszerek