# Immunfestés, ráadásul kétszeres. Szamárvér is lesz a dologoban …

Az alaposan pufferrel (0.1M PB, pH=7.4) kimosott metszeteknél hagytuk abba a beszámolót. De ez egy olyan lépés, ahol a folyamatot pihentetni lehet, ha úgy jön ki. A metszetekből kimostuk az aldehidet, ülnek a fehérjéknek tetsző pH-n és ionkoncentráción, nem sietnek sehova. Ha hosszabb ideig tervezzük tárolni a metszeteket, mielőtt tovább indulnánk, akkor 0.05%os NaN3-at, azaz nátrium azidot kell az oldatokhoz adni.

Ez a ciánhoz hasonlóan bekötődik a mitokondriumokban a légzési lánc enzimjeinek oxigén kötő rézébe és ezért remek gomba és egyéb mikroba ellenes szer. A ciánnál kevésbé veszélyes, minimális figyelemmel veszély nélkül használható (nem szabad nagyobb mennyiséget meginni).

Az állatonkénti 4 üvegből kettővel így is bántunk, eltettük őket tartalékba. A másik két üveg közül az egyikből a metszeteket immunfestés nélkül tárgylemezekre tettük (hamarosan elmondjuk hogyan), hogy megnézhessük milyen a sejtekben a GFP jel. A másik üvegcséket pedig tovább vittük a kettős immunfestére. Azért kettős, mert egyrészt felerősítjük a GFP jelet, hogy minden transzgént kifejező sejtet elcsípjünk, másrészt a két törzs esetében még egy másik anyag ellen is festünk, hogy összevethessük a transzgén jelölés mennyire fed át bizonyos sejtekben található anyagokkal (lásd előző bejegyzés).
Az immunfestés alapjairól már beszéltünk az #agytechnikák rovatban, de itt a részletekbe is belemerülünk, hogy érthetőek legyenek a lépések amiket végrehajtottunk.

Először leültünk és végiggondoltuk, hogy amennyiben a GFP-t, a parvalbumint és a calbndint akarjuk megjeleníteni milyen antitesteket kell használnunk, pontosabban milyen elsődlege és másodlagos antitesteket. Ez egy bonyolult játék, mert a két egyszerre vizsgálni kívánt anyag ellen más-más állatban kell elsődleges antitestet termelni, mert majd ezeknek az állatoknak az az antitestei ellen termeltetett (eltérő színű fluorescens festéket hordozó) másodlagos antitestet kell használnunk.

Így született az abrakadabra ami a jegyzőkönyvben található:

Pimer antitest keverék:
1/2 és 3/2 üvegre: AL071 chicken anti-GFP 1:5000 + AL066 rabbit anti-PV 1:2000 1-1ml
4/2 és 5/2 üvegre: AL071 chicken anti-GFP 1:5000 + AL083 guinea pig anti-Calbindin 1:2000 1-1ml
Secunder antitest keverék:
1/2 és 3/2 üvegekre: S110 Goat anti-Chicken Alexa488 1:500 és S255 Donkey anti-Rabbit Cy3 1:500
4/2 és 5/2 üvegekre: S110 Goat anti-Chicken Alexa488 1:500 és S258 Donkey anti-GuineaPig Cy3 1:500

De mit jelent pl. az: AL071 chicken anti-GFP 1:5000? Az jelenti, hogy a nyilvántartásunkban az AL071 es számot viselő, csirkében a GFP ellen termeltetett antitestet ötezerszeres hígításban kell használnunk. Ezt az egyik transzgénikus törzs esetében a z AL066os kódot viselő nyúlban a Parvalbumin ellen termeltetett antitestet kell keverni kétezer-szeres hígításban, a másik törzsnél pedig a tengerimalacban Calbindin ellen termeltetett antitestet ugyanebben a hígításban.

A második lépcsőben pedig a GFPt jelölő csirke antitesthez, kecskében csirke antitestek ellen termeltetett, zöld fluoreszcens festékkel (Alexa 488) jelölt antitestet kötünk. A megfelelő állat esetében ehhez keverjük a másik antigént felismerő antitestet felismerő pirossal jelölt (Cy3) antitesteket.

Nem gyötröm a hallgatóságot tovább, aki követni tudta kitalál melyik állat, stb.

Ez persze nem ilyen egyszerű. Az antitesteknek, mint minden fehérjének megvan az a rossz szokása, hogy kb. bármihez hozzátapad, így az agyszövethez. Ahhoz, hogy az antitestek hibás tapadását lecsökkentsük, a metszeteket az első lépésben tömény fehérjeoldatba áztattuk. Ez esetünkben 10%os szamár vérsavó volt (már megint egy újabb állat). Aki szemfüles láthatta a jegyzőkönyvben, hogy itt még 0.5% Triton-X100 is volt az oldatban. Az meg minek? Nos ezekben a jól fixált agyszeletekben a sejthártyák köszönik jól vannak és megakadályozzák a nagyobb molekulák, mint pl. az antitestek sejtbe jutását. A 0.5% Triton-X100 egy detergens, egy mosószer, melye a zsíros sejthártyákat kilyuggatja. Ezután könnyebben diffundálnak reagenseink és metszetünkben jelentősen mélyebbre jut be az immunfestés. Ezt a keveréket 40 percig hagytuk rajta a metszeteken és utána öntöttük nyakon a megfelelő antitest keverékekkel.

Ezután jön a türelmes anatómus várakozás, mert a diffúzió lassan dolgozik. Legalább 2-3 órát, de inkább egy napot kell hagyni dolgozni a rendszert. Ezalatt, mint a legtöbb fázis alatt a metszeteket rázógépen rázattuk finoman, hogy elősegítsük a diffúziót.
Úgyhogy itt ugrunk egyet másnapra, amikor is fentről ismert 4x10 perces pufferes mosással lemostuk az elsődleges antitesteket és a metszeteket újabb napra nyakon öntöttük a másodlagos antitest keverékkel. Itt már nem kellett magas fehérjeoldattal blokkolni a tapadást, mert azt egyszer már megtettük.

Még egy nap és jött az utolsó 4x10 perces pufferes mosás. Ezután érkezett el az igazság pillanata, a metszetek tárgylemezre helyezése, lefedése és megkukkantása a mikroszkópban.

De ez majd legközelebb…

Szerző: Gulyás Attila

MikroProject tervezés és felkészülés: fizsó, puffer, fixáló, jegyzőkönyv Hova földelünk, mikor agyi jeleket mérünk?