# Klasszikus molekuláris-genetikai mérő módszerek

Southern, Northern és Western blot: a molekuláris információ három lépésének klasszikus vizsgálati módszerei

Mindhárom klasszikus laboratóriumi módszer, amelyek mind ugyanarra az alapelvre épülnek: egy bonyolult keverékből kiválasztani és azonosítani egy meghatározott biomolekulát.

Vegyünk egy csapat gyereket. A feladat az, hogy válogassuk ki azokat akik olvasni szeretenek, és azokat akik monjuk focizni. A megoldás egyszerű, engedjük be őket egy terembe, melynek egyik végén labdák, másik végén könyvek vannak, majd startjelre hagyjuk őket futni, amerre szeretnének. Hamarost a terem egyik végén a focisták, a másik végén a könyvmolyok, a közepén meg a sánták, mélabúsak és álmosak maradnak. No a molekulákat is iyen "ösztönzőkkel" válogatják szét.

A különbség köztük az, hogy melyik molekulatípust vizsgálják: a Southern blot a DNS-t, Northern blot az RNS-t, a Western blot pedig a fehérjéket méri. Mindhárom technika úgy működik, hogy a mintát először molekulaméret szerint szétválasztják, általában gélelektroforézissel, majd a molekulákat egy membránra viszik át, ahol egy specifikus próba vagy antitest segítségével kimutatják a keresett célt.

Ha precízek akarunk lenni több féle módon is lehet molekulákat méret alapján szétválogatni. Elektroforézissel és gél szűréssel.

Az elsőt a technikai nyelvben futtatásnak hívják. Egy gél-lap egyik végére kicsi üregekbe töltik a molekulakeveréket, majd a gél két végére feszültségkülönbséget kapcsolnak. Mivel minden biológiai molekulának van töltése, ezért elkezdenek a megfelelő irányba vándorolni. A géleket alkotó molekulahálózatban a kis molekulák gyorsabban „futnak” és ezért messzebbre mozognak, a nagyobbak lemaradnak. Kicsit olyan, mintha egy galagonya-bozótosban vagy őserdőben rendeznénk futóversenyt, az apró termetű versenyzők kevesebb ágba akadnak be és gyorsabban haladnak, a termetesebbek lelassulnak és kevesebb távot tesznek meg ugyanannyi idő alatt.

A gélszűrésnél kicsit más a helyzet és a kimenetel. Itt egy gélgyöngyöket tartalmazó oszlop tetejére öntik molekulakeveréket, majd átáramló oldószerrel elkezdik a gélen átmosni őket. A használt géleket alkotó molekulák térhálót alkotnak. A gél előállításainak körülménytől függően a térhálóban vannak különböző méretű üregek. Azok a molekulák akik kissebbek beleférnek egy-egy ilyen üregbe és megakadnak, a nagyobbak ezért gyorsabban haladnak előre. A végeredmény fordítottja lesz az előző módzserének, itt a nagy molekulák érnek át először és a kicsik lemaradnak. Ezt a módszer ti lehet gyerekekkel szemléltetni. Van egy gyerekcsapat, akikben vannak már nagyon jóllakot pocakosak, kicsit jóllakott, kicsit könyebbek, és éhes, vékony gyerekek. Engedjük be őket egy terembe aminek a másik végén knyelmes fotelekben remek filmeket lehet nézni. De! a terem hosszában helyezzünk el egy csomó asztalt, amire mondenféle finomságokat helyezünk el. Mi lesz az eredmény? A terem túlsó végére a legnagyobb, már jóllakott csimoták lrnek át először, aztán a részben jóllakottak, akik csak egy picit álltak meg csipegetni. Legvégül a legsoványabb, legéhesebbek érkeznek, mert ők sok asztalnál megálltak, hogy jóllakassák magukat. Az ismertetett technikákban az első módszert, az elektroforézist használják, hiszen az válogat térben, a másoik inkább időben, mikor mosódik le egy molekula.

A Southern blot Edwin Southern találmánya, és a DNS-szekvenciák felismerésére szolgál. A DNS-t olyan enzimekkel darabolják, melyek jellegzetes helyeken vágnak és az információtartalomra jellemző méretű darabokra szabdalják a DNS-t. A különböző méretű DNS darabokat gélen szétfuttatják, majd az innen membránra átmosott darabokat egy jelölt, komplementer DNS- vagy RNS-szakasz (probe) segítségével hibridizálják. Ez a próba csak ahhoz a DNS-régióhoz köt, amelynek a szekvenciája illeszkedik, így megmutatja, hogy a kérdéses gén vagy mutáció jelen van-e a mintában, és milyen méretű fragmentumban található. A Southern blotot ma főként genetikai állapotok megerősítésére vagy genomiális átrendeződések kimutatására használják.

És még egy blokk, a probe-okról. Watson és Crick óta mindenki tudja hogy a DNS kettős szálú. Ennek azért örültek annakidején annyira, mert egy másolódási mechanizmust is adott. Ugye a G kapcsolódik C-hez és a T az A-hoz. A két DNS szál egymást kiegészíti, komplementerek. No ezt használjuk a probe-okban is. Ha keresünk egy jellegzetes DNS szakaszt, mondjuk GATTACA (egy film címe is), akkor annak komplementere CTAATGT, helyett TGTAATC, mert a két szál iránya ellentétes, azaz meg kell fordítani. No ha csinálunk egy ilyen DNS szekvenciát és a végére biggyesztünk egy festékmolekulát vagy egy színes reakciót katalizáló enzimet, akkor probe-jainkkal, szondáinkkal meg tudjuk keresni és megjelölni a keresett DNS és RNS szekvenciákat. Ha fehérjékre vadászunk, akkor antitesteket kell használni és jelölni (bővebben itt).

A Northern blot ugyanilyen elven működik, de az mRNS-ek kimutatására szolgál. Neve szójáték, a Southern (déli) blot után ezt Northern (északi) blotnak nevezték. Itt a teljes RNS-mintát választják szét gélen, majd a membránra vitt RNS-eket egy jelölt, komplementer próba segítségével detektálják. Mivel a módszer a transzkriptumok méretét is megmutatja, alkalmas alternatív splicing vizsgálatára, génexpressziós különbségek kimutatására vagy arra, hogy egy adott gén mely fejlesztési vagy fiziológiai állapotban aktív. Bár ma az RNA-seq váltotta fel a legtöbb területen, a Northern blot továbbra is rendkívül megbízható és robusztus technika.

A Western blot (a fenti szójáték továbbvitele, nyugati, lehet tippeket adni mit hívhatnánk Eastern, azaz keleti blot-nak) a fehérjék analógiája: a fehérjéket SDS-PAGE segítségével méret szerint szétválasztják, majd membránra viszik, és a célfehérjét egy specifikus elsődleges antitesttel ismerik fel. A jel erősítésére egy másodlagos, enzimmel vagy fluoreszcens jelöléssel ellátott antitestet használnak, így a kívánt fehérje mennyisége és mérete jól láthatóvá válik. A Western blot a mai napig a fehérjekifejeződés és poszttranszlációs módosítások (az elkészült fehérje utólagos módosítása, pl. foszforiláció, gliko-proteinek) egyik legfontosabb vizsgálati módszere, mert nagy specificitást és viszonylag egyszerű kivitelezést biztosít.

Összefoglalva: mindhárom blot technika ugyanarra a logikára épül – szétválasztás, átvitel, célzott kimutatás –, de más-más molekulát céloz. A Southern a DNS-t, a Northern az RNS-t, a Western pedig a fehérjéket teszi láthatóvá, és mindhárom módszer fontos mérföldkő volt a modern molekuláris biológia kialakulásában. Az elsővel a mutációkat láthatjuk, a másodikkal, hogy egy adott szövetben, egy adott pillanatban milyen gének aktívak, azaz íródok át róluk mRNS, a harmadikkal pedig azt látjuk milyen és mennyi fehérje keletkezett, illetve, hogy ezek utólagos módosításra kerültek-e.

In situ hibridizáció: génkifejeződés térképezés

Itt a feladat az, hogy helyben mutassuk ki van-e ott valami. A fenti gyerekes példát használva, ha például azt szeretnénk tudni hol vannak egy réten mondjuk ürgelukak, akkor vegyünk egy nagy csapat gyereket, mindegyiknek adjunk egy lámpát és kérjük meg, hogy azt tegye le egy ürgeuk mellé. Ezután várjuk meg míg leszáll az est és egy drónról fényképezzük le milyen mintában vigítanak a lámpák a réten. Mi kellett ehhhez? Két dolog: egy feladat mit kell keresni és egy jelölés, a lámpa.

Az in situ hibridizáció olyan technika, amellyel meg lehet mutatni, képszerűen, mely sejtekben fordul elő egy (mutáns) DNS szakasz vagy kifejeződik egy adott gén mRNS-e, miközben a szövet térbeli szerkezete érintetlen marad. A módszer lényege, hogy a szövetszeletre vagy sejtmintára egy jelölt, komplementer DNS- vagy RNS-próbát visznek fel, amely csak ahhoz a DNS/mRNS-hez köt, amelynek a szekvenciája pontosan illeszkedik.

A kötődést különböző detektálási megoldások (radioaktív, fluoreszcens vagy enzimes jelölések) teszik láthatóvá, így kirajzolódik, mely sejtek aktívak a vizsgált gén szempontjából. A technika nagy előnye, hogy sejtszintű felbontással dolgozik, vagyis pontosan megmutatja, mely sejtek fejezik ki az adott gént egy bonyolult szövetben – ez különösen fontos az agy heterogén sejttípusainál. A módszer alkalmas fejlődési folyamatok, sejtvándorlási mintázatok és génexpressziós különbségek vizsgálatára is. Az in situ hibridizáció tehát egy olyan térképező eljárás, amely a génexpressziót nemcsak mennyiségileg, hanem térben és sejttípusok szerint is feltárja.

Egyenlőre még maradunk a klasszikusoknál. A következőkben a klasszikus genetikai beavatkozó módszereket tekintjük át.

Szerző: Gulyás Attila

2015-2025 között fejlesztett molekuláris genetikai módszerek Már-már klasszikusnak számító genetikai módosító módszerek