Az előző bejegyzésben lajstromozott technikákhoz képest számos területen történt jelentős fejlődés:

a) célzottan, pontosan, sejttípusokat megcélozva lehet géneket változtatni, javítani, akár nagy méretű transzgéneket bevinni;

b) külső behatással, fénnyel, vegyületekkel lehet géneket, receptorokat vagy ioncsatornákat időlegesen vagy tartósan ki-be kapcsolni;

c) az „omics” technikák lehetővé teszik teljes rendszerek összefüggéseinek megértését;
d) térbeli térképezési technikákkal teljes aktiválódó gén és fehérje kifejeződés-térképek készíthetők;
e) a sejtvonalak és agyterületek fejlődését tudjuk befolyásolni;
f) a nukleinsav és fehérje kölcsönhatások vizsgálatával a genetikai szabályozó hálózatok deríthetők fel;
g) a genetikailag kódolt optikai érzékelő és ingerlő fehérjék lehetőségei jelentősen fejlődtek (erről már írtunk és még fogunk írni korábban)és végezetül
h) az extrém multiomics, ahol számos nagy áteresztő képességű módszert kombinálnak teljes szabályozórendszerek vizsgálatára.

A molekuláris-genetikai módszerek multiomics-ig tartó evolúciója. A vízszintes tengelyen a módszerek megjelenésének éve, a függőlegesen a vizsgált biológiai tartományok vannak feltüntetve.

Azaz, képesek vagyunk hatalmas mennyiségű adatot gyűjteni 3D-ben, egész szervezetek, agyak, funkcionális állapotáról, szabályozó rendszereiről vagy megbetegedések esetén a változásokról. Színes, szagos, multimédiás vizsgálatok lettek elérhetők. Ezekhez persze komoly adatfeldolgozó háttér is kell, megfelelő softwarek és adatanalízis módszerek.

És akkor a meglehetősen hosszú lista, melyből a legelterjedtebb módszereket részletesen is bemutatjuk majd az elkövetkező blogbejegyzésekben.

A genetikai kód célzott javítására alkalmas módszerekkel a genom kódja úgy szerkeszthető, mint egy szöveg a szövegszerkesztőben. III. Modern genetikai szerkesztés és génbeviteli technikák: lehetővé teszik genetikai információ célzott bejuttatását sejtekbe, egyedekbe, pontos genetikai beavatkozásokat tesznek lehetővé, pl. mutációk kijavítását vagy betegségmodellek elkészítését.

10. CRISPR-Cas9 / Cas12 / Cas13 rendszerek: génkiütés, pontmutáció, javítás
betegségmodellek létrehozása, in vivo génterápia alapja
11. Base editorok (A→G, C→T átírás): DNS kettős-törés nélkül precíz pontmutációk beépítése, idegrendszeri betegségek modellezése
12. Prime editing: „molekuláris szövegszerkesztő”, akár több bázis cseréje / beszúrása / törlése is lehetséges, sejttoxicitás alacsony
13. Cre-loxP, Flp-FRT rekombinációs rendszerek: feltételes (conditional) kiütés, sejttípus-, életkor- vagy agyterület-specifikus genetikai módosítás, neurobiológia egyik alapeszköze
14. AAV, lentivírus, rabies vírusvektorok: génbevitel célzott sejtekbe
transz-szinaptikus tracerek (RV, HSV), optogenetikai fehérjék expressziója
15. Transzpozáz alapú génbevitel (Sleeping Beauty, PiggyBac): stabil integráció, nagy méretű transzgén egyszerű bevitele

Vírusbevitelell célzottan fejezhetünk ki kémiailag vagy fénnyel aktiválható ioncsatornákat, melyek rövid vagy hoszabb távon be vagy ki-kapcsolnak idegsejteket. IV. Sejttípus- és környezet-specifikus génmanipuláció: gének kifejeződésének vagy fehérjék működésének célzott, időzített ki vagy bekapcsolását teszik lehetővé. Az agy embriológiai folyamatai és hálózatok működés vizsgálható ezekkel.

16. DREADD rendszer (chemogenetika): Gi, Gq, Gs jelátviteli utak mesterséges aktiválása, viselkedési és hálózatszintű vizsgálatok
17. Optogenetika (Channelrhodopsin, Halorhodopsin, Chrimson, stb.)
fényvezérelt aktiváció/gátlás: neuronhálózatok dinamikájának feltárása
18. Tet-On/Tet-Off rendszerek: időzített génexpresszió, krónikus vs. akut hatások elkülönítése

V. Nagy áteresztőképességű molekuláris profilalkotás (omics): Ezekkel a módszerekkel sejtek vagy agyterületek teljes RNS-, fehérje-, transzkripciós faktor- kifejeződését, epigenetikus-, metabolikus- állapotát lehet meghatározni, gyakran térképszerű, térbeli lokalizációval. Hihetetlenül felgyorsítják a sejttípusok felfedezését és lokalizációját valamint funkcionális és fejlődési sajátságaik felderítését. Lehetővé teszik a fejlődés során a génkifejeződés és genetikai szabályozás mintázatainak felderítését. Nem megcélzott dolgokra kérdeznek rá, hanem mindent azonosítanak és a mérést követő elemzés során bukkannak fel fontos új összefüggések, mechanizmusok.

19. Bulk RNA-seq: agyterületek átlagos génexpressziója, fejlődési és betegségi különbségek vizsgálata
20. Single-cell RNA-seq: egyedi neuronok transzkriptomja, új sejttípusok felfedezése (pl. SOM, VIP alcsoportok)
21. Spatial transcriptomics: lokális génexpressziós térképek agyszeletekben, sejttípus, réteg és funkcionális környezet összekapcsolása
22. ATAC-seq, single-cell ATAC-seq: kromatin hozzáférhetősége: mely gének „nyitottak”, epigenetikai állapotok stresszre, tanulásra, drogokra
23. CUT&RUN / CUT&Tag: transzkripciós faktorok és epigenetikai markerek kötődése, sokkal érzékenyebb, mint klasszikus ChIP-seq
24. ChIP-seq: fehérje–DNS kölcsönhatások feltárása, fejlődési faktorok, CREB, MEF2, c-Fos stb.
25. Proteomika: tömegspektrometriás fehérjekimutatás: foszforilációs térképek, szinaptikus proteomika
26. Lipidomika, metabolomika: membránösszetétel, neurolipidek, glia–neuron interakciók metabolikus profilja

VI. Molekuláris anatómiai és sejttérképezési technikák: Kimondottan a molekulák térbeli elhelyezkedésének vizsgálatára, 2D és 3D szövettérképezésre és elemzésre fejlesztett módszerek. A mérést követő számítógépes megjelenítés során számtalan faktor kölcsönös előfordulását lehet velük megvizsgálni. RNS címkékkel jelölt idegsejtek az agykéregben. Az egyes sejtekre jellemző címkék azok összes axonágában megtalálhatók, így azonosítható mely idegsejt hova vetít.

27. RNAscope: ultraspecifikus RNS in situ hibridizáció, ritka transzkriptumok kimutatása egyetlen sejten belül
28. CLARITY, iDISCO, uDISCO: átlátszóvá tett agyak, 3D immunfestés és génexpresszió vizsgálat
29. Multiplex immunhisztokémia: több tucat fehérje vizsgálata egyetlen agyszeleten, sejttípusok és szinaptikus mintázatok azonosítása
30. BARseq, MAPseq: molekuláris vonalkóddal ellátott projekciós térképezés
axonális célpontok DNS-alapú kódolása

VII. Molekuláris manipuláció és sejt-sors befolyásolása: Idegsejt és agyfejlődést vizsgáló eljárások. Hogyan fejlődnek a sejtvonalak és alakulnak ki az egyes agyterületek. Egy cerebral organoid: mesterségesen növesztett sejtcsoportosulás, melynek felépítése hasonló az agykérgéhez.

31. Lineage tracing (sejtvonal-követés): fejlődés során merre vándorolnak a neuronok, CRISPR-vonalkódolás (homing CRISPR barcoding) modern változatban
32. iPSC technológia: humán bőrsejtekből idegsejtek, asztrociták, oligodendrociták előállítása, betegspecifikus modellek
33. Organoidok (mini-agyak): 3D agyi szövetmodellek, fejlődés, betegségek, droghatások vizsgálata
34. In utero elektroporáció: fejlődő egérmagzat agyába juttatott DNS, réteg- és sejttípus-specifikus expresszió

VIII. Nukleinsav- és fehérjeinterakciók feltárása: A genetkai szabályozó hálózatok vizsgálhatók. A proximity ligation assay működési elve: ha két molekula kellően közel van egymáshoz akkor a két molekulát felismerő antitestekhez kötött rövid, egyszálú DNS szakaszok kölcsönhatásba lépnek és egy erősítési folyamat után festékmolekulákat képesek kötni. Csak ott lesz jel, ahol a vizsgált fehérjék kölcsönhatnak.

35. RNA-bindig protein mapping (CLIP-seq, HITS-CLIP, iCLIP), mely fehérjék milyen RNS-t kötnek, poszttranszkripciós szabályozás
36. Proximity ligation assays (BioID, APEX): fehérje–fehérje és fehérje–RNS közelítő interakciók térképei, sejten belüli mikrodomének feltárása (axon, dendrit, spine)
37. Ribosome profiling (Ribo-seq): mely mRNS-eket fordít le a riboszóma → valódi fehérjetermelés

IX. Optogenetikai módszerek és optikai szenzorok: Transzgénikus technológiákkal előállított feszültség, Ca, inegületátvivő anyag, metabolikus állapot, lipidanyagcsere-érzékelő molekulák, illetve serkentő és gátló opszinok. Ezek kombinációjával egyszerre lehet mérni és befolyásolni az agyi degsejt jelintegrációját és a hálózatokműködését. Illetve vizsgálni az ingerüetátvjvő anyagok felszabadulását és a sejtek anyagcsere állapotát. Az utóbbiakró hamarosan részletesen írunk. Genetikusan kifejezett feszültségérzékeny festékekkel több szerveződési szinten, valós időben vizsgálható az agy működése: agyterületek, kishálózatok, idegsejtek és a sejtek közötti jelátvitel is vizsgálható.

38. Kódolt Ca²⁺-szenzorok (GCaMP-verziók): neuronpopulációk működésének optikai követése
39. Kódolt feszültségszenzorok (GEVI-k): dendritikus integráció és AP-dinamika vizsgálata
40. All-optical physiology: optogenetika + Ca/voltage imaging kombinációja stimuláció és mérés egyszerre

X. Rendszerbiológia (Systems Biology) és Extrém modern multiomics: A rendszerbiológia az élő rendszereket komplex hálózatokként vizsgálja. Nem egyetlen génre vagy fehérjére fókuszál, hanem arra, hogyan hatnak egymásra: génhálózatok, jelátviteli utak, sejt-sejt kommunikációs csatornák, anyagcserefolyamatok.
A multiomics mérések integrációjának lépései és lehetőségei. A számos szinten mért rengeteg adatot együtt dolgozzák fel big-data módszerekkel. Ennek alapján következtetéseket lehet levonni a biológiai rendszerek működéséről, betegség felderítő és gyógyító stragtégiákról és egyéni orvoslási lehetőségekről. Az alapelv: a rendszer több, mint az alkotórészek összege. Az idegtudományban ez azt jelenti, hogy például a stressz, a tanulás, vagy a drogok hatásait nem egy-egy molekula szintjén vizsgáljuk, hanem az egész sejtprogram és hálózat változásait elemezzük.
Itt számos nagy áteresztőképességű módszert kombinálnak, hogy egyetlen sejtben nézzék a szabályozó rendszerek összefüggéseit vagy egyes gének működésének megzavarását követő tovább gyűrűző változásokat figyelve szabályozó (jelátviteli, genetikus)- és anyagcsere hálózatokat derítsenek fel.

41. Multiomics single-cell megközelítések: scRNA-seq + scATAC-seq kombináció
génexpresszió + epigenetika egyetlen sejten
42. Spatial multiomics: térbeli RNS, fehérje és epigenetikai rétegek összeolvasztása, agyszelet „molekuláris térképe”
43. CRISPR interference (CRISPRi) és CRISPR activation (CRISPRa): géncsendesítés vagy aktiválás DNS-vágás nélkül, stabil, finomhangolt génszabályozás neuronokban
44. Perturb-seq: CRISPR-alapú génzavarás + single-cell RNA-seq, funkcionális genomikai hálózatok feltárása
45. Mosaic analysis (MADM, MARCM): sejtspecifikus genetikai mozaikok létrehozása, fejlődés és funkció összekapcsolása

És ígérem itt az ámokfutás vége. Kiemelünk jónéhány sziporkázó technikát és elmerülünk részleteikben!

Szerző: Gulyás Attila

2015-2025 között fejlesztett molekuláris genetikai módszerek