Ez az #agytechnikák rovat bemelegítő bejegyzése. Ahhoz, hogy segítsük a más szálakon bemutatott eredmények megértését, ezen a szálon bemutatjuk majd az agykutatásban használt modern módszereket. A bejegyzés áttekinti a kérdéseket és hogy melyikre milyen módszerrel lehet válaszolni.

A szerelés menete

Az agyműködés megértése (kb., mint bármely rendszeré) hasonló lépésekben történim mint mikor egy kíváncsi gyerek megpróbálja megérteni hogyan működik egy porszívó vagy egy kenyérpirító. Először is (miután kihúztuk a konnektorból) megnézzük milyen elemekből áll: kapcsolók, drótok, motorok. Aztán megnézzük melyik alkatrészből mennyi van, majd azt, hogy az elemek hogyan kapcsolódnak egymáshoz. Ezidáig, egy kikapcsolt, nem működő, mozdulatlan (statikus) rendszert vizsgáltunk. Ezután felbátorodunk és megnézzük melyik alkatrész mit csinál működésben és hogyan hat kölcsön a többivel. Egy összetettebb elektronikus kütyü esetében ezt már csak profik tudják próbálgatni multiméter vagy oszcilloszkóp segítségével.

Egy összetett rendszer megismerésének lépései tehát:

Szerkezet leírás:

-alkotóelemek azonosítása

-miből mennyi van?

-mi-mivel lép kapcsolatba?

-melyik kapcsolatból mennyi van?

Működés leírás

-hogyan működnek az elemek

-hogyan hatnak kölcsön az elemek

-mi fakad a kölcsönhatásból, hogyan viselkedik az elemek összessége (ugye itt lehet megérteni hogy az alacsonyabb szint tulajdonságai hogyan járulnak hozzá a magasabb szint emergens tulajdonságaihoz)

Az agykutatók esetében a szerkezet leírással az anatómus foglalkozik, a működést pedig az élettanászok (fiziológusok) kutatják.

Bővebben legközelebb…

A szerszámosláda

Az agyat alkotó sejtek kicsik (a sejtek központjának a sejttestnek az átmérője 20-30 mikrométer, azaz a méter milliomod vagy a milliméter ezred részéből kell 20at venni). Az őket összekötő nyúlványrendszer ágainak vastagsága (0.3-2 mikrométer) és a közöttük levő szinapszisok (150 nanométer) még kisebbek. A sejteket felépítő fehérjék még ennél is apróbbak. Neo a Mátrixban azt mondta: „I want guns! Lots of guns!”. Az agykutató anatómus azt mondja: „Mikroszkópokat akarok! Sok mikroszkópot!”

A mérettartományban lefele haladva a következő mikroszkópokkal lehet dolga egy anatómusnak:

• sejtek azonosítására:
  • egyszerű fénymikroszkóp (FM),
  • fluoreszcencens fénymikroszkóp,
  • differenciális interferencia kontraszt mikroszkóp,
• sejtek és sejtalkotórészek azonosítására:
  • konfokális mikroszkóp,
  • 2-foton mikroszkóp,
• sejtalkotórészek azonosítására és molekulák elhelyezkedésének meghatározására:
  • a szuperreszolúciós mikroszkópok több fajtája (STEAD, STORM),
  • transmissziós elektron mikroszkóp (EM),
  • elektron tomográfiára alkalmas EM.

Ahhoz, hogy a szürke kocsonyás agyszövetben valamit látni lehessen persze meg kell jeleníteni a sejteket, a sejtekben található anyagokat és a sejtek közötti kapcsolatokat. Ezekre számtalan festést fejlesztettek ki: immuncitokémia, pálya jelölések festékekkel és vírusokkal.

A molekuláris biológia technikáit is lehet megjelenítésre használni: PCR, transzgénikus állatok. De ezekről majd a maga idejében.

A ketyegő idegsejtek és az agy működésének vizsgálatára elsősorban az elektrofiziológia módszereit használják. Ismét lefelé haladva a méretskálán:

• koponyára helyezett sokcsatornás EEG, mely az agy működésmódjáról, sok millió sejt közös zümmögéséről ad információt,
• helyi mezőpotenciál elvezetés (local field potential = LFP), sokelektródás multiunit elvezetés, mely a nagyobb sejtcsoportok működéséről és a rajtuk átfolyó elektromos jelekről szolgáltat információt
• intracelluláris elvezetések (hegyes elektródás és patch clamp), melyek egyetlen idegsejt jelfeldolgozásáról szolgáltatnak észletes információt
• egyedi ioncsatorna elvezetés, azt mutatja meg hogyan járulna hozzá az egyes ioncsatorn vagy receptor fehérjék az elektromos jelek létrehozásához

Képalkotó módszerekkel több ezer sejt vagy agyterület működését lehet megfigyelni: optogenetikai módszereket használva a működő sejtek villognak, illetve lézerfénnyel befolyásolható működésük, a funkcionális MRI segítségével egy feladat során megfigyelhető mely agyterületek mikor aktiválódnak.

A matematikusok és fizikusok is fejlesztettek, hatalmas adatmennyiség elemzésére alkalmas (gyakran látványra is szép) módszereket: PCA, klaszterezés, support vector machine, gépi tanulás, Bayes-i statisztika, kauzalitás vizsgálat, stb., melyek képesek arra, hogy bonyolult összefüggéseket és okságokat tárjanak fel.

És ha már számítógépek és számolás, akkor a modellezés sem maradhat ki. Különböző modellekben a sejtek jelintegrációját, a neuronhálózatok működési mintázatait vagy tanulását vizsgálhatják a kutatók.

Mint azt a Porszívó szétszerelésénél megtudtuk az anatómus a rögzített, mozdulatlan, halott rendszert vizsgálja, hogy meg tudja milyen elemekből áll a rendszere, ezekből mennyi van, mik a lehetséges kapcsolatok és melyik kapcsolatból mennyi van.

Ehhez két alapvető eszköze van: a jelölés és a képalkotás.

Az agyra ránézni alapesetben olyan, mint ha egy lombja hullott őszi erdőre néznénk 10 kilométer távolságról. Egy szürkésbarna elmosódott csíkot látunk. Vegyünk elő egy távcsövet! Megint szürkésbarna elmosódott csíkot látunk, igaz kicsit vastagabbat. Elsőre remek ötletnek tűnhet, hogy fessük be a fákat mondjuk fluoreszkáló narancssárgára, mert az jól látszik. Nosza, fessük be. Az eredmény? Egy narancssárga elmosódott csíkot látunk. Ha viszont mondjuk minden századik fát festjük csak be és távcsővel nézzük akkor 10 kilométerről is remekül látszik majd, hogy a fáknak van törzse, ágai és ágacskái. Sőt, hogy a tölgyfa máshogy ágazik el, mint a bükk vagy a hárs. Egy kis rutinnal a fa faja is megmondható messziről. De ahelyett, hogy magunk festegetnénk azt is megvárhatjuk míg elkezdenek kilombosodni a fák. Egyik korábban kezdi, mint a másik így, ha például naponta fényképezünk még 10 kilométerről is viszonylag jó képünk lesz arról milyen fából mennyi van és milyen alakúak. Sőt az elmosódott csíkban még azt is fogjuk látni, hogy a fáknak van törzse és lombkoronája.

No pontosan ez a sejt és szövetfestési eljárások lényege is. A kutatók olyan anyagokat kerestek, amik csak bizonyos sejteket vagy a sejteknek csak egy bizonyos részét jelölik meg azáltal, hogy a sejtekben található anyagokhoz hozzákötődnek. A Nissl festés az idegsejtek sejttestét és vastagabb dendritnyúlványait jeleníti meg. A Golgi féle ezüstcsapadék festés teljesen véletlenszerűen megjeleníti az idegsejtek kis százalékának (<0.1%) teljes nyúlványrendszerét. Egy DAPI nevezetű fluoreszkáló festék pedig a kromoszómákhoz kötődik és mutatja meg a sejtek magját. Ezek a festések hasznosak, de kicsit a szerencsén múlik, hogy találunk-e olyan anyagot, ami az általunk vizsgált sejtet, vagy sejtrészt jelenít meg.

Ennek a szerencsén alapuló próbálkozásnak az immunfestés vetett véget. A dolog lényege az, hogy egy élőlény szervezetébe egy számára idegen anyag kerül akkor védekezésképpen az immunrendszere az anyag ellen antitesteket termel. Ez történik, ha megtámad minket egy vírus vagy egy baktérium, az immunrendszer idegenként ismeri fel a kórokozó felszínén található molekulákat és ellenanyagot termel ellenük, melyek semlegesítik a kórokozót. Ha tehát például az emberi agyban szeretnénk megtudni mely sejtekben és azokon hol található egy fehérje, akkor az elkülönített emberi fehérjét valamilyen állat, leggyakrabban egér vagy nyúl szervezetébe kell bejuttatni, majd a keletkezett ellenanyagokat kivonni. Ha az ellenanyagunkat valamilyen festékkel megjelöljük, akkor azt magával viszi és amikor rátapad a célfehérjére egyúttal festékkel meg is jelöli azt a helyet. Ilyen módon, ha ismerünk bizonyos sejtekben megjelenő fehérjéket, azonosíthatunk sejttípusokat melyek azokat tartalmazzák. Vagy megnézhetjük azt, hogy a sejt életében és jelintegrációjában fontos molekulák a sejten vagy a sejtben hol helyezkednek el. Ha két (vagy több) különböző anyagot két (vagy több) eltérő színű festékhez kötött antitesttel ismerünk fel, akkor kétféle (vagy több) molekula eloszlását tudjuk összehasonlítani. így például sejttípusok közötti összeköttetések mennyiségét és térbeli eloszlását becsülhetjük, vagy kimutathatjuk egy idegpálya merre halad és milyen elemeken végződik.

Egy másik módszer a célzott festésre a molekuláris biológusoktól jön. Az in situ hibridizáció segítségével feltérképezhetjük azt, hogy egyes gének mely agyterületeken vagy idegsejtekben vannak bekapcsolva. Amikor egy gén átíródik megjelenik mRNSe a citoplazmában. Készíthetünk egy komplementer RNS darabot (probe), mely ezt felismeri és ha ehhez festéket vagy radiokatív izotópokat kötünk

A transzgénikus technikákat is fel ehet használni festésre. Ha egy meghatározott sejtcsoportot ráveszünk arra, hogy kifejezzen egy fluoreszcens fehérjét, például a GFP-t, green fluorescent proteint, azaz zöld fluoreszkáló fehérjét, akkor a sejtek teljes nyúlványrendszere láthatóvá válik fluoreszcens mikroszkópban (a részletekről majd az optogenetikati módszerek leírásánál lesz szó). A brainbow (agyszivárvány) pedig egy olyan módszer ahogy az egyes sejtek véletlen arányban fejeznek ki piros, zöld és kék fehérjéket, ezáltal a szövetben megjelenített több száz sejt mindegyike a szivárvány más színében tündököl és nyúlványrendszere elkülöníthető.

 

Az anatómusok fegyvertárának másik rekesze a Képalkotás. Ahhoz, hogy sejtszinten lássuk hova kötődtek a festékjeink látnunk is kell őket. Erre a sokféle mikroszkópia valamelyikét használjuk.

Ennek nagyítása 10-1000x között mozog. A nagyításnak a fizika törvényei szabnak határt. Ugyanis a felbontóképességet, azt, hogy mi az a két közeli pont, amit még meg tudunk különböztetni egymástól, a használt fény hullámhossza szabja meg. Ez a látható fény esetében 0.5 mikrométer. Ez az idegrendszer esetében a vékonyabb dendritnyúlványok és axonágak átmérője. Szóval ezzel is igen messzire lehet jutni. Lenhossék Mihály, Camillo Golgi és Ramon y Cajal ezt használva írta le az idegrendszert alkotó idegsejtek kapcsolódásának alapvonásait. A két utóbbi Nobel díjat is kapott. A fénymikroszkópoknál nagy lépés volt a fluoreszcens mikroszkóp kifejlesztése, mivel több anyag egymáshoz viszonyított eloszlását lehet, kicsit jobb optikai lehetőséekkel vizsgálni. A fluoreszcens mikroszkópok számos változatáról és használatukról is beszélünk majd a rovatban.

A következő nagy technikai lépés az elektronmikroszkóp feltalálása volt. Persze itt is magyarok voltak a felbújtók. Szilárd Leó (aki elméleti fizikusként papíron kívül máshoz nem nyúlt) 1928ban megpróbálta Gábor Dénest rávenni, hogy építsen elektronsugarat használó mikroszkópot. De működő rendszert Ernst Ruska és Max Knoll épített először. A mai elektron mikroszkópokban 75.000 volttal gyorsított elektronokat használnak a fénysugár helyett és ezáltal a felbontás határát 0.1 nanométerre viszik le, ami 10 milliószoros nagyításnak felel meg. Az idegrendszer kutatásában eddig ritkán megyünk el, mert már 20-50.000x- es nagyítás elég arra, hogy a sejtek közötti kapcsolatokat, a szinapszisokat meglássuk, illetve azonosíthassuk hol helyezkednek el a különböző molekulák a sejtekben.

Az azóta eltelt majdnem száz évben a számítástechnika és optoelektronika fejlődése lehetővé tette a fénymikroszkópok felbontóképességének elméleti határ fölé emelését, számos szuperreszolúciós technika kidolgozását. Furcsán hangzik, hogy lehet az elméleti határ fölé lépni, de majd az erről szóló bejegyzésben ezt elmagyarázzuk. Az elektronmikroszkópia terén is hatalmas a fejlődés a klasszikus TEM (transzmissziós elektron mikroszkóp) mellé felsorakozott az elektron tomográfos TEM és a pásztázó EMek számos fajtája (lásd majd a megfelelő bejegyzést). Mindkét mikroszkópiában fontosak a bonyolult képfeldolgozási eljárások, amikhez most már a mesterséges intelligencia tanuló algoritmusai is csatlakoztak. A fény és elektron mikroszkópia módszereiről későbbi #agytechnikák bejegyzésekben lesz szó.

A Forma 1 egyre gyorsabb és kevesebbet fogyasztó autóit a mérnökök által kidolgozott új megoldások hajtják előre. Hasonlóan, az agykutatás nagy áttöréseit módszertani újdonságok alapozzák meg.

A két, kicsit hasonló ábra azt mutatja, hogy a térbeli skálán (függőleges), mely a nm-től a méterig terjedve lefedi a makromolekuláktól a viselkedő embert, illetve az időskálán (vízszintes) a msec-től a hónapokig terjed, mely agyi folyamatok (felső ábra) és milyen módszerek (alsó ábra) hol helyezkednek el.

Az alsó ábra két részből áll. Jobb alsó sarka a 30 évvel ezelőtt rendelkezésre álló módszereket mutatja. Az ábra fő részéhez képest a különbség az, hogy a korábbi módszerek ábrájának közepe üres, hiányoztak azok a módszerek, amelyek a közepes térbeli és időbeli felbontást tudták vizsgálni. Az elmúlt évtized hatalmas előrelépését, mely összekötötte az alulról és a felülről az agyat vizsgáló kutatókat és ezáltal lehetővé tette, hogy bemutassuk hogyan működik az agy, ezeknek, a lukat betöltő módszereknek (optogenetika, fMRI, mikro stimuláció, sokcsatornás mező potenciálok) köszönhetjük. Ezek tették lehetővé, hogy az agyterületek viselkedés közbeni dinamikája és nagy idegsejt csoportok működése közötti megfelelést vizsgálhassuk. Kicsit hangzatosan szólva, a pszichológiát összeköthessük a neurobiológiával.

A megfigyelhetőség határait térben és időben egyre jobban kitoltuk. A fénymikroszóp megengedte a struktúrák mm és um szintjén való megfigyelését, az elektron mikroszkóp ezt a nm szintjére vitte le, de az atomic force mikroszkóppal már egyedi atomokat is megfigyelnek, akiket ez érdekel. Az idegsejtek működésének megfigyelése a térbeli skálán az agy léptékű felbontástól (EEG) a molekuláris szintű felbontásig (FRET) lehetséges. Az időbeli felbontásban az elektrofiziológiai módszerek az óráktól a milliszekundumig működnek. A képalkotó módszereknél még van mit fejlődni, az fMRI időbeli felbontása 3-5 másodperc (ugye az idegsejt msec szinten működik), térbeli felbontása mm körüli (az idegsejtek mm alatti léptékűek), a 2 foton mikroszkópiában használt feszültség érzékeny festékek felbontása a 10 msec, de már fejlesztik a feszültség érzékeny festékeket, melyek időbeli felbontása vetekszik az elektrofiziológiai módszerek felbontásával (sajnos most, 2022ben érzékenységük még hagy kívánnivalókat maga után).

És ugye nem csak a tér és időbeli felbontás skálájának lefedésében történt hatalmas előrelépés, hanem a párhuzamosan mérhető elemek: molekulák, sejtek, agyterületek számában is. A fenti 2D ábra igazából 3Dben lenne méltányolható, ahol a merőleges harmadik tengely a mért elemek számát mutatná. Itt is hatalmas előrelépések történtek. Manapság már van, ahol 8 idegsejtből vezetnek el jeleket egyszerre voltage clamp elektódával, több száz elektródával vizsgálják a mezőpotenciálokat, sejaktivitást és az EEGt, illetve ezer fölötti agyterületet vagy optogenetikailag jelölt idegsejtet vizsgálnak fMRI vel vagy 2-foton mikroszkóppal.

Ennek a hatalmas adatmennyiségnek az elemzéséhez matematikusoktól és fizikusoktól kölcsönzött és továbbfejlesztett módszereket használnak az idegtudományok. Az igazság az, hogy nem csak a módszereket kölcsönözzük, hanem a matematikusokat és fizikusokat is :). Az agykutatás és a molekuláris biológia kérdéseinek vizsgálatára kialakult a biomatematika. Intézetünkben sok olyan kollegánk van, akik matematikusként, de még inkább fizikusként végezték tanulmányaikat.

A módszerek egy része a jelek feldolgozásával foglalkozik a másik része pedig az összefüggések megtalálásával. Ha egy elem helyett többet vizsgálunk akkor hatalmas kombinatorikai robbanás következik be a lehetséges kölcsönhatások vizsgálatában. Hiszen 1 elem esetén 1 dolgot kérdezhetünk. 2 elem esetében a kölcsönhatások lehetséges száma 2 (oda és vissza), 3 elem esetében már 6, 4 elem esetében 12, 5 elem esetén 20. Egész pontosan N*N-1. Ezt a gombafelhőt adatbányász módszerek használatával lehet elemezni és alapvetően új típusú következtetéseket lehet segítségükkel levonni. Csak néhány példa: a Fourier analízis a jelek ritmikusságát vizsgálja, a kereszt korrelációk vagy kereszt spektrumok a jelek időbeli vagy térbeli összefüggésének megállapításában segítenek, a PCA megtalálja az egymástól függetlenül ható elemkombinációkat és ezáltal a kölcsönhatásokban fontos és nem fontos elemeket el tudjuk különíteni egymástól, az ICA megmutatja melyik elemkombinációk mivel járulnak hozzá a hatáshoz, klaszter analízissel összefüggő csoportokat lehet kialakítani, Markov analízissel kitalálhatjuk milyen állapotokon keresztül mehet át a rendszer és ezek milyen valószínűséggel követik egymást, Granger kauzalitás vizsgálattal a kölcsönhatások irányát és erősségét lehet becsülni. Sok módszernek az a lényege, hogy a rengeteg adatból kibogarásszuk mi a lényeges és mi a lényegtelen, illetve, hogy a rengeteg lehetséges összefüggésből levont következtetések melyike csak véletlen és melyik, ami igazán fontos. A kapcsolatrendszerek elemzésére, pedig a gyorsan fejlődő hálózat elmélet módszereit használjuk.

A szivárvány színeiről, majd számos további bejegyzésben fogunk beszámolni.

Kérdés a mai napra: Téged a szivárvány melyik eleme fogott meg a legjobban? Melyik szintet és milyen időablakban vizsgálnád?

A mikroszkópok palettáját már röviden bemutattuk, most kicsit alaposabban vesszük végig melyik mire is való és hogyan kell megfesten a mintákat használatukhoz.

Ezeket az apró törékeny szövetdarabokat a feldolgozási fázis alatt többször is meg kell vizsgálni, hogyan zajlanak a reakciók. Erre használjuk az általában 10x-100x-os tárgylencsével és 10x-es szemlencsével felszerelt egyszerű fénymikroszkópokat, melyek nagyítása így 100-1000x-es. Ezeken a nagyításokon agyi területek, bennük a sejtek, valamint axon- és dendritnyúlvány rendszerük azonosítható. Az „egyszerű fénymikroszkóp” kifejezés azért túlzás. A kutatók nem az iskolák által megfizethető minőségű mikroszkópokat használnak, hanem jelentősen drágább lencserendszerű, komoly gépeket. De ez kell is, mert ha valaki napi 4-6 órát ül a mikroszkóp előtt akkor nagyon hamar fejfájást kap, ha annak képe nem tökéletes. Egy iskolai és egy kutatómikroszkóp között kb. akkora a különbség minőségben és árban is, mint egy Trabant és a legújabb merdzsó között. Az egyszerűtől (balra)az összetetteb (fény és fluoreszcens vizsgálatra is alkalmas, digitális képfeldolgozó rendszerrel felszerelt, jobbra) mikroszkópok ára 3 és 30 millió forint között mozog.

De milyen festéseket is vizsgálunk fénymikroszkóppal és mire jók ezek? Az egyik alap festés a Nissl festés, melynek során megfelelő sorrendben, kémiailag előállított festékekben mossuk a metszeteket. Ennek során az idegsejtek sejtteste és vastagabb dendritágai kék színnel megjelölődnek. Ezzel a festéssel csak annyit tud meg az ember, hogy hogyan csoportosulnak a sejtek, azaz segít az agyterületek megtalálásában.
 
Mondjuk ez a „csak” is komoly lépésekhez vezetett az agykutatás korai fázisában. Ennek alapján térképezték fel az Öregek az agyat. Korbinian Brodman német anatómus észrevette, hogy az agykéreg eltérő területei jellegzetes, szinte vonalkód szerű, sejteloszlás mintázatot mutatnak. Ennek alapján az emberi agyat 52 cytoarchitektonikai (sejtépítészeti) területekre osztotta. Ezekről a területekről később kiderült, hogy mindegyik más agyi feladat megoldását végzi.

A klasszikus kémiai festések repertoárját nem érdemes tovább listázni, mert az immunfestés és a transzgénikus sejtjelölések teljesen kiszorították használatukat. Nézzük meg mi is az az immunfestés (immuncytokémiának vagy immunhisztokémiának is mondják). Ugye a klasszikus festékek kémiai-fizikai kölcsönhatással tapadtak bizonyos sejtekhez vagy sejtalkotórészekhez. Nem sok lehetőség volt a célzás megváltoztatására és újabb festések kifejlesztése próba-szerencse alapon ment. Ezzel szemben az immunfestéssel majdnem tetszőleges sejtalkotó molekulák megcélozhatók. Azaz, ha van egy sejttípusra jellemző fehérjém, vagy egy sejtalkotó részhez kötődő másik fehérjém akkor, ha ezekre célzok sejttípusokat, vagy sejtalkotó részeket tudok azonosítani. Hogy is történik ez. Mondjuk egy egérben található fehérje ellen szeretnék ellenanyagot készíteni. Először is tiszta formában elő kell állítani ezt az anyagot, majd ezt bejuttatni egy másik állatfaj szervezetébe. A fehérjét ez a faj idegenként ismeri fel, fertőző betolakodónak véli és immunsejtjei ellenanyagot kezdenek termelni ellene. Egérbe ugye nem adhatom be, mert egy faj saját fehérjéi ellen nem termel ellenanyagot normál esetben, ha igen nagy baj van, autoimmun betegségnek hívják. Leggyakrabban nyulakat, tengerimalacokat, lovakat, szamarakat használtak erre a célra. De manapság már hatékonysági és állatvédelmi okokból is sok ellenanyagot immunsejtek tenyészetében állítanak elő. Az elkészült ellenanyag azonban, ha hozzákötődik az agyszelethez még nem látszik, hiszen nem nyel el semmilyen színű fényt. A legegyszerűbb esetben a keletkezett ellenanyag molekulához lehetne festékanyagot kötni, hogy látható legyen. De ezt két okból sem használják. Egyrészt így viszonylag kevés festékanyag utazna az antitesttel a szövetbe és a festés nem lenne elég érzékeny. Másrészt minden ellenanyagot meg kellene jelölni festékkel és így árulni a „boltban”. Ez nem egy gazdaságos logisztikai megoldás. Ezért fejlesztették ki az indirekt (közvetett) immunfestést.

  Itt azt a jelenséget használják ki, hogy ha az A fajból származó antitestet beadom B fajnak akkor a B faj ellenanyagot termel az A faj ellenanyaga ellen. Ezek után ha ezt az antitestet B-anti-A megjelölöm festékkel és az immunfestés során egy második lépcsőben használom két legyet ütök egy csapásra. Egyrészt miután az első, mondjuk nyúlból származó antitest (primer antibody), akár több példány is, hozzákötődik a célfehérjéhez, a második lépcsőben kecskében nyúl ellen termeltetett antitestet köthetek a nyúl elsődleges antitesthez. Ha ezt a kecske-anti-nyúl fehérjét megjelölöm festékkel, akkor egyrészt mivel ebből is több kötődhet az elsődleges antitesthez jelentős jelerősítést érek el. Másrészt a „boltban” elég egyfajta festékkel jelölt antitestet árulni minden egyes faj antiteste ellen (lehetne olyan antitestet is előállítani amely minden faj antitestét felismerné, de így csak egy fajta festéket tudnánk bevinni és elvesztenénk a többszörös festés lehetőségét, ennek nem sok értelme lenne).
De a dolgok itt nem álltak meg. Ahhoz, hogy az immunfestés érzékenységét tovább fokozzák két trükköt dobtak be a kutatók. Egyrészt megfelelő trükköket használva egy harmadik antitest réteget is bele lehet dobni a szendvicsbe ezzel tovább növelve az egy célfehérjére tapadó molekulák számát. Másrészt az ellenanyaghoz nem egy festékmolekulát, hanem egy színes molekulák képződését katalizáló fehérje enzimet kötnek. Így minden egyes harmadik rétegi antitest többezer festékmolekulát horgonyoz le a szövetben a kellő helyen, szép erős kontrasztú jelet eredményezve.

Mit is láthatunk ily módon? Ha egy fehérjemolekula mondjuk egy sejttípus minden elemében megtalálható akkor a 3 réteg antitest és az enzimreakció után a fénymikroszkópban láthatjuk ezen sejtek teljes nyúlványrendszerét. Kis nagyításon (100-400x) láthatjuk merre futnak a sejtek dendritjei és axonjai. Azaz az adott sejttípusok milyen területen gyűjtik a bemenetüket és hova küldik jeleiket. Ezzel ugye megtehetjük a hálózatkutatás első lépéseit: milyen elemeink vannak, ezekből mennyi van. Nagyobb nagyításon (1000x) már azonosíthatjuk az axonon a terminálisokat és megszámolhatjuk a sejttípus mennyi kapcsolatot létesít saját magával.

De az immunfestést tovább is lehet bonyolítani. Amennyiben két eltérő fajból származó ellenanyaggal két célanyagot jelenítünk meg két eltérő sejtcsoportban, majd a megfelelő (meglehetősen bonyolult szabályoknak eleget tevő) antitest szendvicset építjük fel és a dolog végén két eltérő színű festéket gyártunk a kötött enzimekkel, akkor párhozamosan egyszerre két sejtcsoport nyúlványrendszerét vizsgálhatjuk. Itt a 2x annyi több lesz, mint 2x. Ugyanis így megnézhetjük azt is, hogy az egyik színnel jelölt sejt nyúlványai létesítenek-e kapcsolatot a másik színnel jelölt sejteken (lásd ába, ahol egy távoli agyterületről érkező fekete axonok kapcsolatokat létesítenek a barnával jelölt célsejteken). Tovább léphetünk a megismerés létráján, mert a korábban azonosított elemek között megállapíthatjuk a kapcsolatok lehetséges irányát és ezek mennyiségét is. Máris viszonylag jól állunk egy hálózat kapcsolatrendszerének megértésében, és idáig még csak fénymikroszkópot használtunk.

Az előzőbejegyzésben bemutaott technikák jellemezték a neuroanatómiát az 1980-2000es években. Jelentős továbblépést a jóminőségű, elérhető fluoreszcens mikroszkópok megjelenése és az ezzel járó fluoreszcens festék fejlesztés jelentette.
Mi is az a fluoreszcens festék és miért fontos? A fluoreszcenciajelensége nevét a fluorit ásványról kapta, melyet az emberi szem számára nem látható (bár azt károsító) UV (ultraibolya) fénnyel megvilágítva az kékes-lilán világít, azaz a spektrum (szivárvány, színskála) egy általunk nem látott tartományában ráeső fényt elnyelve egy általunk látható fényt bocsájt ki. A fluoreszcencia során, tehát egy megfelelő hullámhoszúságú fénnyel megvilágított molekula azt elnyeli, majd gyakorlatilag azonnal egy alacsonyabb, jól meghatározott hullámhosszúságú fényt bocsájt ki. Amikor a fénykibocsájtás nem azonnali, hanem elnyújtott akkor beszélünk foszforeszcenciáról.

No de mi az a spektrum? Hát a szívárvány színei és azon túl. Mint azt James Clark Maxwell felismerte a fény elektronmágneses sugárzás. Az elektronmágneses sugárzásnak sok fajtája van. Mindegyik fajtáját jellemzi, hogy mekkora energiát hordoznak az őt közvetítő részecskék a fotonok. Ez meghatározza azt is, hogy az adott elektromágneses sugárzásnak mekkora a hullámhossza. Minél nagyobb az energia, annál rövidebb a hullámhossz. A rádióhullámok hordozzák a legkisebb energiájú fotonokat, ezért ezek hullámhossza a legnagyobb: a kilométertől a milliméterig terjed. A legenergikusabb rádióhullámok a mikrohullámok után a távoli infravörös és infravörös sugárzás következik µm-es hullámhosszal. Ezután következik a látható fény hullámhossza, mely a 800 nmes (nanométer a méter egy milliárdod része) vörös fénytől a 400nmes ibolyáig terjed. Ezen TÚL van az ibolyán-túli sugárzás az UV, melynek hullámhossza 400nm alatt van és azért károsíthatja szemünket, bőrünket, mert sok energiát hordoz. A legkeményebb UV után a Röntgen sugárzás, majd a gamma és a kozmikus sugárzások következnek. Ezek már olyan energikusak, hogy ionizáló sugárzásoknak hívjuk őket és tartani kell tőlük, mert DNS károsodást és ezért sejthalált, illetve rákot okozó mutációkat keltenek.
Visszatérve, mi itt most a látható fénytartománnyal, illetve a közeli UV és közeli infravörös (IR) tartománnyal fogunk dolgozni.

De miért fontos a fluoreszcencia jelensége számunkra? Számos okból. A legfontosabb, hogy a klasszikus fénymikroszkópiában a mintánkat elárasztjuk fénnyel melyet a festékek elnyelnek, árnyékot vetnek. Mivel az optikai rendszer sosem tökéletes, mert a lencserendszer, de még inkább a biológiai minta jelentősen szórja a fényt, a fénymikroszkópban keletkező szórt fény igen lerontja a képminőséget, és ezáltal csökkenti a festés érzékenységét, valamint kontrasztját. Amennyiben az antitest-szendvicsre a fényelnyelő festékek és ilyen festékeket termelő enzimek helyett fluoreszcens festéket kötünk, abból számos előnyünk származik.
 

De hogy ezt kiaknázhassuk speciális mikroszkópra, fluoreszcens mikroszkópra van szükségünk. A fluoreszcens mikroszkóp egy nagyon keskeny hullámhossztartományba szorított gerjesztőfényt használ a megvilágításra, melyet megfelelő szűrőket használva megakadályoz abban, hogy a megfigyelő szemébe vagy manapság ennél sokkal érzékenyebb CCD kamerákba jusson. Ezt a gerjesztő fényt a megfelelő helyre horgonyzott fluoreszcens molekulák elnyelik és alacsonyabb hullámhosszon (más színben) kibocsájtják. A mikroszkóp a megfigyelő irányába csak a molekulák által kibocsájtott fényt engedi át, így a sötét háttér előtt erősen világít, amit keresünk. Gondoljuk végig mit könnyebb észrevenni, a napos égen magasan repülő madarat, vagy egy a sötét erdőben egy ugyanolyan távol világító lámpát? Ily módon a szórt gerjesztő fény zavaró hatása eltűnik.

Eddig tehát, fluoreszcens festéket használva jelentősen növeltük az érzékenységet és képminőséget. A következő nagy lépést az teszi lehetővé, hogy a vegyészeknek a fluoreszcens festékek hatalmas repertoárját sikerült előállítaniuk. A gerjesztő és kibocsájtott fény spektrumát széles határok között lehet tologatni, azaz elérhető, hogy számos nem átfedő színű fényt kibocsájtó molekulát használjunk egyszerre.

Míg a klasszikus immuncitokémiával egyszerre maximum két anyag előfordulását lehetett vizsgálni, addig immunfluoreszcens festésekkel rutinszerű 4 vagy esetleg több anyag eloszlásának vizsgálata. Ez meghatványozza a kapcsolatrendszerek felderítésének lehetőségét és a sejtek működésében fontos molekulák térbeli azonosítását. Például az egyik festék megjeleníti az idegsejtek magját, két másik egy-egy sejtcsoportot, egy harmadik festékkel pedig a sejtek közötti szinapszisokban található anyagokat megjelölve meg tudjuk mutatni, hogy a két sejt alkot-e kapcsolatot egymással.

A fluoreszcens mikroszkópok használatában a következő lépésére akkor került sor, amikor a molekuláris biológusok medúzákból izolált fluoreszkáló fehérje géneket kezdtek el egerekbe építeni. Ily módon elérhető, hogy különböző sejtcsoportok más színű fehérjéket fejezzenek ki és így már immunfestésre sincs szükség ahhoz, hogy sejttípusokat és azok kapcsolódási rendszerét azonosítsuk. Az is megoldható, hogy a sejtek csak akkor világítsanak, ha bizonyos gének bekapcsolnak. Ezzel az embrionális fejlődés lépései is tanulmányozhatók. Nem csoda, hogy a GFP (green fluoreszcent protein, azaz zölden fluoreszkáló fehérje) felfedezéséért és az ezen alapuló mérési módszerek kidolgozásáért Osamu Shimomura, Martin Chalfie és Roger Y. Tsien munkásságát 2008-ban kémiai Nobel díjjal jutalmazták. Ha például 3 elérő színű fehérjét véletlen mennyiségben fejeznek ki a sejtek, akkor minden egyes sejt a szivárvány más színében világít. Ez adja a BRAINBOW (agyszivárvány) technika csodálatos képeit.

És mikroszkópból van még jópár féle! Te mire használnál amit itt tanultál?

Viszonylag sokat kellett várnotok a mai bejegyzésre, de az #agyhirek rovatban egy olyan frissen megjelent cikket mutatunk majd be, ami komolyabb felvezetést igényel.

Az élőlények felépítésének és működésének megismerésében nagy lépés volt teljes genetikai állományok szekvenálása (a DNSt alkotó bázispárok sorrendjének megállapítása), a DNSben rögzült információ kiolvasása. Az első teljes genetikai állományt, egy bakteriális vírusét 1976ban szekvenálták meg. Az első nagyobb genomot, a sörélesztő genetikai állományát20 évvel később 1996ban sikerült teljesen felderíteni. Ezt követte 2000re a tarsóka, a fonálféreg és az ecetmuslinca, mind a biológusok modellszervezetei. 2001 és 2002 az ember és az egér genetikai anyagának megismerését hozta. Mára kb 700 állat és 400 növény teljes genetiaki anyagát ismerjük.
 

Egy faj DNSében hordozott információ felderítése azt teszi lehetővé, hogy megtudjunk hány gén szükséges egy organizmus működéséhez, illetve, hogy a géneken kívül még milyen elemek találhatók a DNSben. Amikor az emberi genomot feltárták, a tudósokat kicsit meglepte, hogy mindössze 23 ezer gént találtak, mely mindössze a DNS információ tartalmának 1/5ét tette ki. A genom 80%ának funkcióját még csak sejtik, Korábban szemét (junk DNA) DNSnek hívták, de mára már sejtik, hogy a génkifejeződés szabályozásában játszik jelentős szerepet. A különböző élőlényekben található gének száma erősen variál, és ami meglepő, nem sok összefüggést találtak egy élőlény génjeinek száma, kromoszómáinak száma és teljes DNS hossza között. Itt is látszik, hogy az evolúció barkácsol, ha valami működik az elég. A szójababnak például kétszer annyi génje van, mint az embernek. Miért???
A mára megismert több száz genom összehasonlító analízise számos eredményt hozott. Egyrészt az élőlények rokonsági kapcsolatait, a Darwin által oly sokat emlegetett törzsfa szerkezetét jelentősen pontosabban ismerjük. Az állat és növényrendszertanban az elmúlt évtizedekben a törzsfa számos, korábban problémás ágát „ültették” át új helyre. Az összehasonlítás másik hozománya, hogy sokat megtudtunk a gének és a szabályozórendszerek szerkezetéről és evolúciójáról.
De itt a dolgoknak még csak a kezdetén voltunk. A DNS tartalma mindössze azt mutatja milyen gének vannak jelen egy élőlényben. Azt, hogy ezek a gének mikor működnek, azt a DNS szekvenciából legfeljebb csak igen közvetve lehet találgatni. Márpedig egy élőlény szervezetét alkotó minden szövet, minden eltérő típusú sejtjében más gének aktívak (ettől mások a sejtek, más dologra képesek). Ráadásul egyetlen sejtben is változik, hogy az egyedfejlődés vagy működésének eltérő fázisaiban mely gének működnek.

A két szülői ivarsejt összeolvadásakor beindul egy genetikai program, melynek során a gének a belső környezet és a külső ingerek hatására meghatározott sorrendben kapcsolnak be és ki. Mint amikor felépítünk egy házat, az egyes munkafázisokban más anyagokra és más szerszámokra van szükségünk.
Szerencsére vannak módszerek arra, hogy megállapítsuk egy adott sejtben milyen gének vannak éppen bekapcsolva. Ugyanis ahhoz, hogy a DNS információjából a funkciót végrehajtó fehérje keletkezzen a megfelelő DNS szakaszról (génről) az információt el kell szállítani a fehérjék előállítását végző sejtszervecskékhez, a riboszómákhoz. Ez úgy történik, hogy azok a DNS szakaszok, amelyekről a sejt adott állapotában fehérjét kell készíteni megkötnek egy enzimet, mely a kromoszómákban védetten elhelyezkedő DNSről az információt átmásolja egy DNShez hasonló, de csak egy fehérje információját hordozó molekulára (ezt a folyamatot átírásnak, transzkripciónak nevezik), az RNSre, mely azt a riboszómákhoz szállítja, ahol azok az RNSben hordozott információ alaján fehérjéket készítenek (ez a fordítás, transzláció folyamata).

Érdekes tény: a gyilkosgalóca mérge az átírást végző enzimet gátolja, azaz megszünteti a genetikai információ kiolvasását. Nem véletlen, hogy ilyen gyilkos méreg. Mire hatását látjuk, már olyan alapvető károkat okozott, hogy a mérgezett menthetetlen.

A génátíródás lehetősége és az RNS jelenléte lehetővé teszi, hogy egyrészt elcsípjük a sejtben éppen jelenlevő RNS molekulákat, illetve letapogassuk azokat a DNS szakaszokat, amelyek nyitva állnak gének átírására. így lehetséges megállapítani azt, hogy mely gének aktívak egy bizonyos sejtben egy bizonyos helyzetben.

De van itt egy bökkenő!!!!

Nem is kicsi.

Az emberi szervezetben 30 trillió, 3x1013 sejt található. Igaz ezek szövet típusokba csoportosulnak, azaz nem mindegyik sejtben eltérő a bekapcsolt gének halmaza, de azért marad elég variáció. Ráadásul ez egy adott pillanat. Az egyedfejlődés alatt, amikor a megtermékenyített petesejtből kialakulnak a szerveket alkotó sejtek, a sejtek az osztódások során számtalanszor funkciót váltanak. Nagyon gyorsan pörgő sorrendben számos gén kapcsol be és ki. Azaz nem csak térben, de időben is változik a sejtek génkifejeződése. A lehetséges aktivált génkészlet száma csillagászati. Az ember 23.000 génje, ha jól emlékszem kombinatorikai tanulmányaimra 2²³⁰⁰⁰ módon kapcsolható be. Ennyi atom nincs az egész világegyetemben.

Génkölcsönhatások az idegrendszeben.

Szóval munka akad elég. A genetikai szabályozás felderítésére alapvetően két megközelítés létezik. Az egyik, hogy kísérletekkel megnézzük, egy adott szövetet alkotó sejttípus esetében milyen gének vannak bekapcsolva, illet mely géneket lehet aktiválni ezekben a sejtekben. A másik egyre fontosabb megközelítési mód a génszabályozás hálózatának számítógépes elemzése és modellezése. A kísérletezők által összegyűjtött adatok alapján az elméleti szakemberek képesek felrajzolni, hogy a gének milyen módon segítik vagy akadályozzák egymás kifejeződését. De jelentős újdonság, hogy az eddigi adatok alapján már jól működő becsléseket is lehet arra tenni, hogy egy korábban még nem megvizsgált DNS szakasz milyen módon hathat kölcsön más DNS szakaszokkal. Ezáltal a mérésekkel felderített szabályozó hálózatok kiterjeszthetők.
 
Az agyterületek kialakításában fontos gének szabályozó hálózata

A szabályozó hálózatok ismeretében modellekben vizsgálhatók az egyedfejlődés során a test és a szervek kialakulása során bekapcsolódó génhálózatok. A számítógépben is futhat az embriogenezis, az élőlény kifejlődése.

A tüdő kialakulásában szerepet játszó gének kölcsönhatások megjelenítésére alkalmas interaktív program

„Mára ennyit a tudományok újdonságaiból.” (copyright: Kudlik Júlia :)

A kapcsolódó következő bejegyzésben azt járjuk majd körbe, hogy a női reprodukciós ciklus szabályozásában szerepet játszó egyik idegmag sejtjeiben milyen gének kapcsolódnak be a menstruációs ciklus eltérő időpontjaiban és ezáltal milyen módon változik meg a sejtek működése.

Emlékeztek még rá mi a különbség a kromoszómáinkban lévő DNS és a sejtekben átíródott RNS között?

A DNS ugye tartalmazza lehetséges génjeinket és ezek szabályozó elemeit. Az RNS-be viszont minden egyes sejt esetében csak azok a gének és egyéb szabályozó elemek íródnak át, amelyek az élőlény adott sejttípusának adott állapotában működnek. Egy sejtben található RNS vizsgálatával tehát pillanatfelvétel készíthető egy meghatározott funkciójú sejtről egy adott pillanatban. Ahhoz lehet hasonlítani, hogy van egy szakácskönyvünk (DNS) amiből barátunk születésnapjára kiválasztjuk kedvenc ételét, kijegyzeteljük egy papírcetlire (RNS), majd a cetli alapján elkészítjük az ételt (fehérje).

Intézetünk munkatársai, Hrabovszky Erik és munkacsoportja, nemrég megjelent cikkében azt vizsgálta, hogy a női ivari ciklus és a termékenység szabályozásában, a pubertásban és a menopauzában fontos szerepet játszó agyi idegsejtekben milyen gének aktiválódnak. A vizsgált sejtek a hypothalamus-ban találhatók. A hypothalamus az agynak az az ősi és életfontosságú része, mely a központi idegrendszer és a test működésének szabályozását hangolja össze. Több alterülete (idegmagja) felelős a hormontermelés szabályozásáért és ezáltal meghatározó a test alapvető homeosztatikus funkcióinak irányításában. Az egyik magjában található kisspeptin tartalmú idegsejtek érzékelik a petefészekben a peteérés körül termelődő ösztrogén mennyiségét és ezáltal részt vesznek a női nemi ciklus (menstruáció-peteérés) szabályozásában. De az élet során az ivari ciklus beindításában (menarche), majd annak leállását követően (menopauza) is fontos élettani szerepük van. Alapvetően meghatározóak tehát a termékenység szabályozásában.
Hrabovszky Erik és munkatársai arra voltak kíváncsiak, hogy a sejtekre ható ösztrogén milyen változásokat okoz a kisspeptin sejtekben, mi változik meg abban, ahogy ezek a sejtek a külvilágot érzékelik, és a nemi ciklus különböző fázisaiban hogyan változik viselkedésük. Mely génjeik aktiválódnak, illetve kapcsolnak ki a nemi ciklus két ellentétes fázisában?
Ha valaminek a változására vagyunk kíváncsiak, akkor meg kell nézni mi-mire változik, azaz kell egy A és egy B állapot, amit összehasonlíthatunk. Ahhoz, hogy a kutatók megnézhessék a sejtek milyen géneket fejeznek ki a ciklus azon részében amikor az ösztrogén szintje alacsony (menstruáció), eltávolították a kísérleti állatok petefészkét, hogy az ne termelhessen ösztrogént. Egy részükben (A csoport) így nézték meg a kisspeptin sejtek RNS készletét, másik részükben (B csoport) pedig egy kis kapszulát ültettek az állat bőre alá melyből a petefészek eredetű ösztrogén hiányának pótlására alkalmas ösztrogén hormon (ösztradiol) szabadult fel, peteérés körüli állapotra jellemző vérszintet eredményezve. Ezután összehasonlították a két RNS mintázatot.

Hogy mindezt megtehessék, a legmodernebb technikai fegyvertárat kellett használniuk.
Az elsőként az egerek kb. másfél centis agyából ki kellett keresniük azt a néhány 10 mikrométer méretű idegmagot (nucleus arcuatus), amiben a kisspeptin sejtek vannak. Ehhez a „laser-dissection” módszert használták. A megfelelő módon elaltatott állatok agyát villámgyorsan lehűtötték, hogy „befagyasszák” a sejtek biokémiai folyamatait és ezáltal megőrizzék az adott pillanatban jelenlevő RNS molekulákat. A fagyasztott agyból vékony, 20 mikrométer vastag szeleteket vágtak. Ezután az egér agyának térképét felhasználva (mert hogy ilyen is van) kikeresték a megfelelő apró agyi magot a hypothalamusban, majd azt egy erre alkalmas mikroszkóp alatt lézerrel körbevágták és egy mintagyűjtő kapszulába gyűjtötték.

A következő lépésben azt vizsgálták meg, hogy a mintákban milyen RNS molekulák és milyen mennyiségben vannak jelen. Ehhez valamennyi RNS molekulát először komplementer DNS-é alakították át reverz transzkripcióval. Itt a klasszikus genetikai információáramlás DNS->RNS irányával ellentétes irányba RNS->DNS másolják az információt egy retrovírusokból származó enzim segítségével. Erre a lépésre azért van szükség, mert a szekvenálás technikai elemei az egyszálú RNSt nem tudják használni, ehhez kettőszálú DNSre van szükség. A kapott DNS szakaszok bázissorendjét nagy áteresztőképességű új generációs szekvenálással derítették fel. Így derült ki, hogy a jelenleg ismert mintegy 56000 transzkript közül 16000 kisspeptin idegsejtekben is előfordul. Ahhoz, hogy ezt a hatalmas adatmennyiséget értelmezni lehessen modern bioinformatikai módszereket használtak: speciális célprogramokat és interneten elérhető genetikai adatbázisokat. A változások hatását a sejtekre a genetikai analízis mellett immunfluoreszcens festéssel és a sejtek aktivitásának elektrofiziológia vizsgálatával is ellenőrizték. Azaz megint felbukkant az a tény, hogy a modern neurobiológiai kutatásokhoz számos diszciplína szakemberének együttműködésére van szükség.

Tehát mit is találtak kollegáink?
Az ösztrogén aktivált kisspeptin sejtekben, az ösztrogén nélküli alapállapothoz képest (ugye A-t hasonlítjuk össze B-vel) a 16000 azonosított elembő 1190 átíródó elem (transcript) szintje nőtt meg és 1139 szintje csökkent. De miért átíródó elemről (RNS-re átírt DNS szakasz) és nem génről beszélek? Eddig mindig csak génekről beszéltem, ez kicsit pongyola volt. Ugyanis a DNSről RNSre nem csak a sejtműködésben szerepet játszó fehérjék információja íródik át, hanem olyan RNSek is melyek transzkripciós faktorokat kódolnak. Ezek olyan fehérjék, amelyek a DNS-hez kötődnek és más gének átíródását szabályozzák (egyszerre több gént is ki vagy bekapcsolhatnak). Ezek fontos résztvevői a genetikai szabályozó hálózatnak. A fehérjéket kódoló ún. hírvivő (messenger) RNS-eken kívül, számos, már önmagukban is szabályozó funkcióval rendelkező RNS molekula került az utóbbi években azonosításra (mikroRNS-ek, hosszú nem-kódoló RNS-ek). Ezek között is bőségesen előfordult olyan, melyek mennyisége ösztrogén függőnek bizonyult.

Egy-egy pont egy átírt elem kifejeződésének erősségét mutatja. Bal oldalt a csökkent erősségű elemek, jobb oldalt az erősödött kifejeződásű elemek találhatók, A kék területen azok az elemek tallhatók melyeknek mennyisége nem változott jelentősen.

A cikkben részletes elemzés szól arról, hogy a több mint 2000 megváltozott átíródó elem milyen funkciócsoportokba tartozó fehérjéket kódol, illetve milyen szabályozó rendszerekhez tartozik. A kisspeptin sejtekben az ivari ciklus során megváltozik számos ingerület-átvivő anyag receptorának mennyisége, különböző más receptor típus mennyisége, a sejtek anyagfelvételéhez és leadásához szükséges szállítómolekulák (transzporterek) mennyisége, sőt még a sejtek anyagcseréjében elengedhetetlen szerepet betöltő mitokondriumok fehérjéinek mennyisége is. A megváltozott átíródó elemek számottevő része transzkripciós faktor, azaz ezek maguk is majd további genetikai elemek kifejeződését változtatják meg.

A kissppetin sejtekben ösztrogén hatásra az ingerületátvivő anyagokban és azok receptoraiban bekövetkező változások összefüggései.

No de mindettől mennyivel lettünk okosabbak? Megtudtuk, hogy milyen módon érzékelik a külvilágot a kisspeptin sejtek (milyen receptoraik vannak), illetve hogyan reagálnak (milyen működő fehérjéik vannak) az ivari ciklus eltérő fázisaiban. Az azonosított gének között számos olyat találtak, melyek mutációja az orvosi szakirodalom szerint a pubertás és a termékenység zavarait okozza. Ennek alapján feltételezhető, hogy a tanulmányban leírt további gének is fontosak lehetnek a fenti zavarokban, ezért új kutatási és gyógyítási irányokat jelölhetnek ki. Ezenkívül fontos adalékokkal járulnak hozzá a menopauzát (a női nemi ciklus és a menstruáció leállása) követő, csontritkulást és további tüneteket kiváltó ösztrogénhiány kialakulásának megértéséhez és lehetséges gyógyítási irányok kereséséhez.

Az anatómusok arzenáljának egy eddig nem említett fontos elemei a különböző kapcsolat és pályakövető eljárások. Ugye, mint korábban vázoltuk egy rendszer megértésében az elemek lajstromozása után a következő lépés az az, hogy melyik elem melyikkel van összekötve. A kapcsolatok lehetnek helyi kapcsolatok különböző sejtek között, illetve távoli kapcsolatok agyterületek között.
Az egy adott területen található idegsejtek helyi kapcsolatainak kvalitatív (leíró jellegű, milyen típusok léteznek) és kvantitatív (megszámoló, melyikből mennyi van) felderítésére más módszereket használnak, mint az agyterületeket összekötő pályák, vetítések vizsgálatára.

A sejtek közötti kapcsolatok felderítése
A legkorábbi módszer, ami alkalmas volt idegsejtek finom nyúlványrendszerének megjelenítésére és ezért a sejtek közötti kapcsolatok felismerésére és leírására, a Golgi festés volt. Jelentős szerepet játszott a XIX. század végén a neuronális – retikuláris vitában, azaz abban, hogy az idegsejtet egyedi, egymástól elválasztott idegsejtek alkotják vagy pedig a sejtek egy folyamatos hálózatot alkotnak. A festést Camillo Golgi olasz anatómus dolgozta ki és a retikuláris elmélet mellett érvelt vele. De végül ugyanezt a festést használva Santiago Ramon y Cajal spanyol anatómus sikeresen érvelt a neuronális elmélet mellett azzal, hogy megmutatta az érintkező nyúlványok között rések, szinapszisok találhatók. Szentágothai János, ki a napokban lett volna 110 éves, a Golgi festés használatával írta le az agykéreg és a kisagy szerkezetét.

Ez a festés bár gyönyörű, de sajnos teljesen véletlenszerűen jelöli a sejteket és így, ha az összes sejttípus lehetséges kapcsolatrendszerét kívánnánk leírni sokat kellene várnunk. Amikor megjelent az immunfestés (lásd) és annak lehetősége, hogy egyes sejtcsoportokat és nyúlványrendszerüket célzottan megjelenítsük a kapcsolatok felderítése magasabb fokozatba kapcsolt. Kettős immunfestéssel az egyik sejttípust barnára, a másikat pedig feketére festve felderíthető és számszerűsíthető a sejtek kapcsolatrendszere: mely sejtek mely másik sejtnek melyik részén és hány kapcsolatot alkotva végződnek. A kétfajta immunfestés elektron mikroszkópban is elkülöníthető és a szinapszisok jelenlétét ezen a szinten lehet bizonyítani.
De az elmúlt évtizedben kidogozott transzgénikus és mikroszkópos technikák ezt a módszert is nyugdíjazták. A Nobel díjjal jutalmazott zöld fluoreszcens fehérje és népes családja lehetővé teszi, hogy párhuzamosan infravörös/vörös/sárga/zöld/kék és ibolya színben jelentessünk meg a sejteket és nyúlványrendszerüket, azáltal, hogy az egyes sejttípusokban más színben fluoreszkáló fehérjéket fejeztetjük ki (erről bővebben, később). Ráadásul a kapcsolatok bizonyításához manapság már elektronmikroszkópra sincs szükség. A fluoreszcens mikroszkópok továbbfejlesztett változata a konfokális mikroszkóp (hamarosan erről is írunk) pont addig tolta a látható fény által alkotott kép felbontását, hogy már egy ilyen fénymikroszkóppal is kimutathatunk két sejt között szinapszist, sőt képfeldolgozással még félautomatikusan meg is számolhatjuk hány szinaptikus bemenet érkezik mondjuk egy gátlósejt-típustól egyetlen serkentő sejtre. Itt a biztonság kedvéért egy plusz trükköt kell használni. Az egy dolog, hogy látom, hogy egy zölddel jelölt axonterminális nekifekszik egy pirossal jelölt dendritnek, de óvatos duhajként (merthogy a kutatók azok) meg kell győződjek arról, hogy nem csak egymás mellett van a két elem, hanem hogy ott valóban szinapszis is van. Számtalan olyan fehérje létezik, amely csak a szinapszisokban található: átvivőanyag receptorok receptorok, szinaptikus hólyag fehérjék, sejtfelszíni kapcsoló molekulák, stb. Ráadásul, ezek a fehérjék mások a serkentő és a gátlósejtekben! Ha a feltételezett kapcsolatot alkotó axont és dendritet jelölő eltérő színű fluoreszcens festékek mellett még egy másik színnel a szinapszisban található fehérjét is megjelölöm egy harmadik színnel (leggyakrabban fluoreszcens immunfestéssel), akkor bizonyíthatom a két elem között a szinapszis (aktív kapcsolat) jelenlétét, sőt még azt is hogy az serkentő vagy gátló kapcsolat-e. Ha mondjuk zöld axon és a piros dendrit között mint a szendvicsben a sonka, ott van a kékkel jelölt GABA receptor is, akkor egy gátló bemenetről van szó, ha nincs ott akkor csak véletlen túl közel futott a két nyúlvány, de kapcsolatot nem létesítettek. Ha egy képfeldolgozó algoritmussal megnézem, hogy hány helyen található kék pixel piros és zöld között, akkor még automatikusan meg is számolhatom hány ilyen kapcsolatom van. Nem csoda tehát hogy az agyi kapcsolatrendszer, a konnektóm mehatározása rohamléptekben halad.

Az agyterületek közötti kapcsolatok felderítése
Annak megállapítására, hogy mely agyterületek vannak összekötve egymással részben eltérő módszereket kell használni mint a helyi kapcsolatok meghatározásához. Itt ugye azt kell felderíteni, hogy mely agyterületről indulnak axonok, merre futnak és hol végződnek. Egy pálya vajon csak egy célterületre vetít vagy elágazik és több helyre is?

Az axonok lefutását két alapvető módon lehet követni: 1) ha az axont elvágjuk akkor a sejttesttől távolabbi része elpusztul, majd lebomlik (degenerálódik) és ezt megfelelő festéssel ki lehet mutatni. 2) az axonokban kétirányú anygaszállítás (transzport) zajlik és a különböző jelölőanyagokat előre vagy visszafelé szállítják. Vannak anyagok, amelyek a sejttestből az axonterminálisok felé áramlanak (anterográd transzport, ezek az axon felépítéséhez és működéséhez szükségesek anyagok, leggyakrabban fehérjék) és vannak anyagok amik az axonvégződések felől a sejttest felé áramlanak (retrográd transzport). Megfelelő anyagok sejttestbe, vagy az axon végződésének területére juttatva a pálya lefutása, illetve a pályát indító idegsejtcsoportok felderíthetők.

Axondegenerációt pályafelderítésre először August Volney Wallner, angol élettanász használt. Jóval később Szentágothai János és tanítványai (Halász, Fleró és Mess) is ennek segítségével írták le a hormonrendszer szabályozásában alapvető hipothalamusz-hipofízis rendszer szerkezetét és működését.

Finomabb felbontás és többszörös pályakövetés vált lehetővé amikor több olyan anyagot találtak, melyeket az idegsejtek csak a sejttestből az axon felé (anterográd) vagy az axonvégtalpak felől a sejttest felé (retrográd) szállítanak. Ha például egy babból kivont lektint, a PHAL-t juttatjuk be az idegsejtek közé akkor azok felveszik azt és a sejt teljes nyúlványrendszerét kitöltik. A PHAL-t azután immunfestéssel megjeleníthetjük és megnézhetjük mely agyterületekre jutott el. Ha a célterületen található idegsejteket egy másik színnel megjelöljük, akkor még azt is megállapíthatjuk, hogy a pálya mely sejttípusokon végződik. Ha arra vagyunk kíváncsiak, egy terület honnan kap jeleket, akkor más anyagokat: torma egyik enzimét (HRP) vagy wheat-germ-agglutinin-t (WGA, búzacsírából kivont és a vértesteket összecsapó hatású anyag) kell a sejtek közé juttatni. Ezt az ide futó axonok felveszik és visszaszállítják anyasejtjükhöz, ahol megfelelő festéssel ki lehet mutatni ezen felhalmozódó anyagokat, sőt kettős festéssel azt is azonosíthatjuk, hogy ez a pálya milyen sejttípusból eredt.

Immunfestett idegsejt, melyen egy másik agyterületről érkező axonok végződnek. A sejtben található fekete szemcsék azt  jelzik hogy ugyanaz a sejt vetítő axonokat is küld arra a területre ahonnan a bemenetet kapja. A kapcsolat tehát köcsönös a két agyterület között, ráadássul egy sejttípus vesz benne részt.

Közbevetés: A lektinek
Épp az imént két olyan növényi anyagot is felsoroltunk (PHAL és WGA) ami szeret hozzákötődni az idegsejtek felszínéhez. Mind a kettő a lektinek családjába tartozik. A lektinek a növények védekező rendszerének tagjai. Egyik növény sem kedveli, ha megeszik. Mivel elfutni nem tud ezért mérgeket termel, hogy a támadója rosszul érezze magát miután evett a növényből. Vannak gyorsan ható mérgek, mint például a krumplifélék atropinja, a mákfélék opiátjai vagy a gombák (ugyan ők nem növények, de ők sem tudnak elfutni) muszkarinja. De van a növényi mérgeknek egy gyenge, gyorsan ható családja a lektinek, melyek a növényevők bélfalához, idegsejtjeihez és immunrendszerük fehérvérsejtjeihez tapadva okoznak zavarokat. A manapság sokat emlegetett gluténnek is ilyen tulajdonságai vannak. De ide tartoznak a csírázó gabonafélékben található búzacsíra agglutininek (WGA) és az összes hüvelyesben, kisebb nagyobb mértékben megtalálható egyéb lektinek (például a PHAL vagy VVA).
Amikor ezeket megesszük, belünk sejtfalához kötődnek és az érzékenyebb emberekben bélgyulladásokat, autoimmun betegségeket és egyes eredmények szerint még neurodegeneratív betegségeket (Alzheimer és Parkinson kór) is kiválthatnak.

Erre biztos sokan felhördülnek: No de hát, ha a lektinek, pl a glutén, meg a hüvelyesek alkotói gyenge mérgek, akkor miért esszük meg őket? Az európai kultúra gyökere a gabona, nem?
A helyzet az, hogy a hagyományos táplálkozásban a kenyeret kovásszal, több napos kelesztéssel készítették. A kovász egy összetett mikrobiológiai életközösség és a benne található élesztőgombák és tejsav baktériumok lebontják a glutént, eltüntetik a lektint. A hüvelyesekben található lektinek főzés során elbomlanak. Kivéve a szójabab lektinjeit… Csak az európai ember eszi meg a szójababot teljes lektintartalmával együtt az ételeihez adott szójaliszt formájában (ami a világháború alatti fehérjehiány pótlására használt a hadigazdaság). Ázsiában, ahol a szója alap élelmiszer, azt mindig erjesztett (lektinmentes) formájában fogyasztják (szójaszószként, natto-ként, tofu-ként, tempeh-ként vagy csíráztatás után csíraként), mert tudják, hogy a kezeletlen szójabab gyengén mérgező. Nem csoda, hogy fogyasztói társadalmunkban, ahol a kenyeret szódabikarbonával (még csak nem is élesztővel) készítik mindenki gluténallergiás, hiszen a kenyérkészítés kulcslépése, a glutén lebontása kimarad.

Ezzel még nincs vége a pályakövetési eljárásoknak. A legfirnyákosabb dolgok még hátra vannak. Várjátok a következő bejegyzést! Abban lesz Drakula is (november 18.án)!!

Van ám a pályajelölésnek egy harmadik módja is: a transzneuronális jelölés, azaz amikor a jelölés nem áll meg egy idegsejtnél, hanem annak célsejtjeit is megjelöli a szinapszisokon keresztül hatolva. Ezzel a módszerrel egész kapcsolat láncolatokat lehet feltérképezni. Igazából már a Waller féle axonelvágásos módszer is tudott így működni. Ugyanis, ha egy idegsejt elveszti bemeneteinek nagy részét akkor elpusztul és kisvártatva azok az idegsejtek is elpusztulnak, akiknek első sejtünk küldte volna az ingerületet (ha nem kaptak máshonnan számottevő bemenetet). Tehát ha van egy pályánk, ami meghatározó bemenete egy rendszernek akkor így az egész rendszer felépítése követhető, ha egyre későbbi időpontokban megnézzük hol tart a pusztulás az agyban.

A másik idegsejteken végig-ugráló jelölőanyag a veszettség vírusa. A veszettség egy lassan, de könyörtelenül előretörő betegség. Amikor egy rókát egy másik veszett róka megharap, akkor a sebben végződő idegrostokon keresztül bejut a vírus az érző idegsejtekbe. Itt megindul a vírus szaporodása, majd amikor a sejt elpusztul a kiszabaduló vírusrészescskéket felveszik az adott agyi területre vetítő axonok, visszaszállítják a vírust sejttestükbe és a ciklus kezdődik elölről. Néhány naponta egy-egy újabb ugrással egyre nagyobb részei fertőződnek meg az agynak, mígnem az életfontosságú rendszerek leállásakor az állat elpusztul. Ez a lépcsőzetes ugrálás az oka annak, hogy a veszett állat viselkedése folyamatosan változik. Kerüli a fényt, kerüli a vizet, nem tud aludni és éjszaka is mozog, túlságosan barátságossá válik, majd agresszívan támadó és harapós lesz. [Itt jegyzendő meg, hogy a vámpíroknak tulajdonított tulajdonságok legtöbbje jellemző a veszett állatokra. Drakula gróf korában valószínűleg egy különösen erős veszettség járvány lehetett Erdélyben].
Persze épeszű kutató nem fog a veszettség eredeti vírusával dolgozni. De itt jönnek a már a sejtösszeköttetéseknél megjelent modern technológiák. Géntechnológiai eljárásokkal a veszettség vírusának rokonait és más vírusokat is alkalmassá tettek arra, hogy pályakövető eljárásokra lehessen őket használni. Az eljárások során a vírus genomjából kitörlik a korlátlan szaporodáshoz szükséges géneket, illetve további biztonsági mechanizmusokat építenek be. Az így módosított vírusokat egy adott agyterületbe juttatva elérhető, hogy csak bizonyos sejttípusok által alkotott pályákat is lehessen vizsgálni. Sőt, a vírusok tudnak egy szinapszisnyit is ugrani, tehát megvizsgálható, hogy mely agyterületek mely sejtjei létesítenek kapcsolatot azokkal a sejtekkel, akik épp az általam vizsgált területre vetítenek.

Egér agyának különböző síkokban készített metszetei. A piros foltok azokat az agyterületeket jelölik ki amelyeknek idegsejtjei információt küldenek a jutalom érzékelésében fontos agyterületbe, a striátumba. Az alsó sorban a felül bekeretezett részletek vannak kinagyítva. A sejteket módosított veszettség vírussal jelölték meg.

Bonyolult, de hasznos... és körülményes, mert még ezekkel a legyengített vírusokkal is csak speciálisan felszerelt laborokban, megfelelő képzés, védőoltások és engedélyek birtokában lehet csak dolgozni.

De a pályajelöléshez nem kell feltétlenül vírusokat használni. A különböző színű fluoreszcens fehérjéket a vetítő pályarendszerekben is ki lehet fejezni. Sok színt használva felderíthetjük egy adott terület mely területektől kaphat bemenetet (konvergencia) illetve egy terület mely területekre ad kimenetet (divergencia).

És végül a nagy agyi pályarendszerek követésének leggyorsabb és legmodernebb módja a „diffusion tensor imaging” amely az MRI scannerek speciális használatával és képfeldolgozási módszerek segítségével állapítja meg merre futnak a nagy agyi pályák. A működési alapelve igen szellemes. A hosszú agyi pályarendszerekben futó axonokat többszörösen feltekeredett gliasejt sejthártya hüvelyek veszik körül, hogy az axonok elektromosan szigeteltek legyenek és ezáltal a jelterjedés felgyorsuljon. Úgy néz ki, mintha egy seprűnyélre jónéhány réteg csomagoló fóliát tekernénk. Ez az elrendezés azt eredményezi, hogy a sejtekben található víz a seprű (axon) hossztengelyében irányában könnyebben mozog, mint arra merőlegesen. A mérés során egy időpillanatban elektromágneses sugárzással gerjesztik a vízmolekulákat, majd egy kicsivel később megnézik, hogy épp hol vannak a gerjesztett molekulák. A vízmolekulák elmozdulása alapján ki lehet számolni milyen irányba futnak az adott agyterületen a rostok, ezáltal a pályák haladásának irányát fel lehet térképezni. Bár a dolog igen népszerű manapság az agy összeköttetési rendszereit, a konnektómot, vizsgáló elméleti szakemberek között, van egy szépséghibája! Nem tudja megmondani a rostkötegben merre áramlik az információ, hiszen a vízmolekulák az axon tengelyében mindkét irányban elmozdulhatnak, akár az akciós pontenciál terjedésével ellentétes irányba is. Szerencsére az agyterületek közötti kölcsönhatások irányát más módszerekkel (sokcsatornás EEG) meg lehet határozni.

A hatékony kapcsolattérképezéshez a fénymikroszkópokat is felturbózták egy kicsit. Az axonvégződések vizsgálatához szükséges nagyításon a mikroszkóp látómezejébe körülbelül egy 150x150 mikrométeres terület képe fér bele és csak körülbelül 20 miron mélységben láthatunk éles képet. Képzeljük el, ha egy apró egéragy egészét szeretnénk ekkora darabokból feltérképezni hány látómezőt kellene végignéznünk. Nem kell képzelni számolni is lehet egy látómező térfogata 0,15x0,15x0,02 köbmilliméter, egy egér agy térfogata kb 25x20x15 milliéter. A kettő hányadosa 17 millió körül mozog. Ht ennyit végigbogarászni senki se fog. Ezért a mikroszkópokat fejlesztő cégek mérnökei automatikus rendszereket készítettk, melyek képeseket teljes egér agyak automatikus lefényképezésére. Két módszer is létezik. Az egér agyat fixálás és festés után behelyezik egy mikrotómba (metszetkészítő gépbe). Minden egyes metszet levágása után az agy felszínét hatalmas felbontású CCD kamerákkal látómezőnkét és mélységenként lépegetve lefényképezik, majd újabb metszetet vágnak és kezdik előlről.

A másik módszerhez még csak nem is kell lemetszeni az agyat, mert a „light sheet microscopy”, fény-sík mikroszkópia használatánál a mintát egy nagyon keskeny fénysíkban megvilágítják és a síkra merőlegesen pedig lefényképezik. Végiglépegetve a síkokon és scannelve a szinteket az egész agy letapogatható a jelölt elemek után. Persze mindkét mikroszkó típus hihetetlenül drága és nagyon-nagyon-nagyon alaposan végig kell gondolni mit akarunk vele megvizsgálni, mert egy letapogatás 2-3 napig eltart és számos terabájtni adatot eredményez. Ennyi adatot már nem is emberi szemmel kell átvizsgálni, hanem képfeldolgozó algoritmussal BIG DATA módszereket használva. Eredményként szuper 3D adatázisokat kapunk, melyek megmutatják egyes agyterületek milyen más agyterületekkel vannak összekötve. Ezen eredmények feldolgozása már hasonló módon történik a Hubble és a JWST űrtávcsövek képeinek feldolgozásához, ahol is a képeket egy tudós csapat állítja elő, azokat mindenki számára elérhetővé teszi, majd a képeket a tudományos közösség minden lehetséges irányból megvizsgálva von le következtetéseket és közöl felfedezéseket.

Az elemek és a kapcsolatok elemzésének módszerei után az #agytechnikák rovatban legközelebb a rendszer elemeinek és kölcsönhatásának viselkedését vizsgáló elektrofiziológiai módszereket vesszük sorra.

A legutóbb az igáslovaknál hagytuk abba, igaz a fluoreszcens mikroszkóp, már doppingoltnak számít. Hasonló képpel élve ma a táltosokkal és a hétfejű sárkányokkal ismerkedünk. Már csak azért is, mert ezek a mikroszkópok áruk miatt saját istállókban, intézeti műszerközpontokban laknak, ahol számos kutatócsoport használják azokat, eben szakemberek segítik a kutatókat. Intézetünkben is van egy ilyen műszerközpont, ahol számos megtalálható az alanti mikroszkópok közül. Segítségükkel számos kiemelkedő közlemény született mely az idegsejtek jelátviteli folyamataiban szerepet játszó molekulák pontos elhelyezkedését és kölcsönhatásait mutatta ki.

Azt, hogy egy mikroszkóppal mekkora nagyítás érhető el azt nem az optikus ügyessége, hanem fizika törvényei határozzák meg. Pontosan a Rayleigh féle összefüggés, mely azt mondja ki, hogy az a távolság, aminél közelebbi két pontot nem tudunk elkülöníteni arányos az alkalmazott fény hullámhosszával. [Pontosabban a vizsgálatra használt hullám hullámhosszával, hiszen az elektron mikroszkópokban nagy energiájú elektronokat használnak képalkotásra, akiknek nagy energiájuk miatt rövid a hullámhossza és ezért lehet velük nagy nagyításon is éles képet kapni.] Az összefüggés oka a kvantummechanika furcsaságaiból adódik (szóródás, határozatlanság): az apró méretek tartományában, a fotonok és atomok szintjén a kölcsönhatások valószínűségi alapon működnek és a részecskék hullámtermészete meghatározóvá válik. Ezért egy klasszikus képalkotó fénymikroszkóp felbontóképessége a látható fény hullámhosszával (380-750nm) összemérhető, legjobb esetben 0.2mikrométer. Ezzel vékonyabb dendriteket és axonágakat még épp látni, de finomabb felbontás nem érhető el.

De mégis…. a fizikusok és mérnökök ravaszkodásai, az optikai és számítástechnikai módszerek fejlődése számos módját tette lehetővé, hogy kijátsszuk ezt a törvényt.
A konfolkális mikroszkópia egy viszonylag egyszerű trükkel, ha nem is jelentősen, de javít a képen.

Az optikai képalkotáshoz lencséket használnak. Egy elméletileg tökéletes lencse a tárgy egyetlen pontjából érkező fénysugarakat a kép egyetlen pontjába vetíti. De, mint a világban sok mindenből, lencséből sincs tökéletes. Ráadásul egy mikroszkópban két-három lencsecsomag van. Ehhez még hozzáadódik, hogy a fény míg eljut a tárgytól a képig szóródik azon a közegen, amiben terjed. A biológiai mintákban, mivel sokféle anyag nagyon kis léptékben összesűrített keverékei, ez a szóródás kimondottan erős. Mindezek a hibák egy mikroszkópban kétirányú szóródást eredményeznek. Egyrészt a fókuszpontba nem csak a tárgytól érkezik fény, hanem annak környezetéből, másodrészt, fordítva a tárgy képe nem csak a fókuszpontba képződik le, hanem köré, elé és mögé is. Ezért egy éles pont képe elmosódottan érkezik a szemünkbe vagy a kamerába. A konfokális mikroszkóp legegyszerűbb formájában a „spinning disk” azaz forgó korong mikroszkópban azt a trükköt használják, hogy a mintát egy a tárgy közelében elhelyezett kis lukon keresztül világítják meg és egy ugyanilyen kis lukat mozgatnak összehangoltan a kialakuló kép síkjában. Az első maszk letakarja a tárgyat megvilágító fénykúp zavaró részét, míg a második maszk pedig csak azt a fényt engedi át, aminek pontosan a mintapontból kell érkeznie és kizárja azt, ami a környezetéből jutna a detektorba. Ha a két maszkot a pici lukakkal összehangoltan és a mintát soronként letapogatva mozgatjuk, egy élesebb képet kapunk. Ráadásul mivel a szórt fény nagyrésze a megvilágított tárgy síkja előttről és mögöttről származik, ez az eljárás a 3D mintát 2D síkonként képes letapogatni. A vizsgálat során síkról-síkra mozogva 3Dben tudjuk letapogatni a mintát és így a 2D pixelek (négyzetek) helyett 3D voxeleket (kockákat) kapunk. Az így felvett térbeli képekből utólag számítógéppel tetszőleges síkokat vághatunk ki. Ugye a felbontás elméleti korlátját itt úgy játsszuk ki, hogy plusz információt viszünk a rendszerbe: tudjuk, hogy az a foton, amit a képpontban mérünk melyik pontról eredt. A módszer neve - konfokális, azaz con-focal, azaz együtt fókuszált- erre utal. A legtöbb esetben fluoreszcens mikroszkópiát használnak, hiszen itt csak a vizsgált elemek világítanak és jelentősen kevesebb a zavaró fény.
 A konfokális mikroszkópok fejlettebb formájában a tárgyat letapogató maszk helyett lézer fénnyel pásztáznak (elvileg a lézernyaláb már önmagában is keskeny, de tovább fókuszálható) és egy apró nyílással (pinhole) korlátozzák, hogy honnan érkezhet fény a detektorba. A konfokális mikroszkóp, „viszonylag” olcsó volta miatt lassan szintén a neuroanatómusok rutin képalkotó eszközévé válik. A felbontás javulása nem jelentős, de lehetővé teszi finomabb idegsejt nyúlványok, például dendrittüskék megjelenítését. Ami fontosabb, hogy gyorsan és hatékonyan lehet 3Dben letapogatni az idegsejteket, ez pedig jelentősen megkönnyíti szerkezetük 3D rekonstrukcióját, akár automatikusan is.

Másik előnye, hogy több színű fluoreszcens festéket használva jól tanulmányozható sejtnyúlványok és különböző molekulák egymáshoz viszonyított térbeli elhelyezkedése.
 
A konfokális mikroszkópián is sikerült még egyet csavarnia a fizikusoknak és mérnököknek, így jött létre a két és sok-foton mikroszkópia, mely tovább javította fénymikroszkópia felbontását. Ez is egyfajta fluoreszcens mikroszkópia és a konfokalitás elvéhez hasonló módon működik, azaz egy megvilágított ponttal pásztázza a mintát. De egy ravasz trükkel nagyon kicsire tudja zsugorítani az egyszerre megvilágított terület méretét és ezáltal javítja a kép felbontását.
   
A fluoreszcens mikroszkópiánál írtuk, hogy ott a festékmolekula elnyel egy jól meghatározott energiájú, és ezért meghatározott hullámhosszú, azaz színű fotont és egy annál kicsivel kisebb energiájú, hosszabb hullámhosszú, a szivárvány vörös vége felé eltolódott színű fotont bocsájt ki. A festéket azonban úgy is lehet gerjeszteni pontosan fele akkora energiájú (azaz vörösebb) de nagyon erős fénysugárral világítjuk meg. A nagyon erős nyalábban annyi foton van, hogy egyszerre két félenergiájú foton is eltalálhatja a festékmolekulát és ezáltal az gerjesztődik. De miért vacakoljunk ezzel? Minél alacsonyabb hullámhosszúságú (alacsonyabb energiájú) egy foton, annál kisebb mértékben szóródik a mintában. Ezért egyrészt mélyebbre tud hatolni egy mintában, másrészt nem melegíti fel és ezért nem károsítja annyira. A másik jelenség a fontosabb: egy fókuszálatlan fénnyalábban nem elég erős a fény intenzitása, hogy ott a fluoreszcens festékmolekulák gerjesztődjenek és fényt bocsátsanak ki. Viszont, ha a fénysugarat fókuszáljuk, akkor a fókuszponthoz egyre közelebb kerülve egyre nagyobb lesz a fotonok mennyisége egy térrészben (hiszen ugyanannyi foton van a nyalábban, csak sokkal kisebb helyre szorítva).

Megfelelően beállítva a fénynyaláb erősségét elérhető, hogy csak az elméletileg végtelenül kicsi fókuszpontban induljon be a két vagy többfotonos festék gerjesztés és ezáltal a gerjesztett terület nagyon kicsi lesz, a letapogatást nagyon finom felbontásban tudjuk elvégezni. A másik trükk, hogy a kibocsájtott fotonok közül nem csak azokat tudjuk elcsípni, akik az objektív felé mennek, hanem érzékelőkkel a mintát minden irányból körbevehetjük és így a műszer érzékenysége többszörösére nő. Ha a nyalábintenzitás kellően magas, nemcsak fotonpárral, hanem több, mondjuk három, harmad energiájú fotonnal is gerjeszthetjük mintánkat, tovább csökkentve ezzel a minta károsodását.
Ahhoz, hogy ilyen fényintenzitásokat lehessen elérni nagyon speciális és nagyon drága lézerrendszerek szükségesek, ahol egy gerjesztő lézer fényét táplálják bele egy speciális kristályba, mely a folyamatosan beáramló energiát femtosecundumos (a másodperc 1015-öd része, ezalatt a fény 0,3 nanométert tesz meg) időablakba sűrítve egyszerre adja ki. Egy ilyen rendszer ára, a megfelelő mikroszkóppal együtt manapság 200 millió forint körül indul. Cserébe lehetővé teszi azt, hogy élő agyszövetben is meg lehessen figyelni a biológiai jelenségeket igen jó térbeli és viszonylag jó időbeli felbontással.

A képen egyetlen denditág szerkezetének változását követték 8 napon keresztül. Látható, hogy a tanulás során a denriten új tüskék jelentek meg és régiek tűntek el.

Hogy a 2-foton mikroszkópiát alkalmazó képalkotó eljárásokat az agyműködés felderítésében hogyan lehet használni, azt majd az optogenetikáról szóló bejegyzésben mutatjuk be. Lehet például látni, hogy a gondolkodó agyban hogyan villannak fel egy-egy pillanatban az éppen működő idegsejtek.

Míg a konfokális mikroszkópiával a felbontást a mikrométer negyedéig (~200nm) sikerült kitolni a szuperreszolúciós mikroszkópok ezt még egy nagyságrenddel tolták el a ravasz trükkök egy másik kategóriáját alkalmazva. Ezekkel a műszerekkel már egyedi molekulák elhelyezkedését, sőt akár élő szervezetbeli mozgását is követni lehet. Ezek a mikroszkópok bizonyos szempontból az elektronmikroszkópok helyett olcsóbb és egyszerűbb megoldásokat nyújtanak.

Működésük két trükkön alapul:
Az egyik trükk a STED (stimulated emission depletion) mikroszkópia. Itt egy ravasz optikai rendszerrel a fluoreszcens festékek azon tulajdonságát használják ki, hogy míg a festéket egy adott hullámhosszúságú fénnyel gerjeszteni lehet egy másikkal megakadályozható a molekula fénykibocsájtása. Ha egy egyszerű gerjesztő fénysugárral világítjuk meg a mintát, akkor a kép bal oldalán látható területről kapunk jelet. Ha ezzel egyidőben a kioltó fény ravaszul megformát (középen sötét) fénynyalábjával vesszük körül a gerjesztő sugarat (a kép közepén), akkor a fénykibocsájtás sokkal pontosabban lokalizált (jobb oldali kép) és ezáltal a kép felbontása jelentősen javul, a konfokális felbontás 200nm-éről 50nm-re.

Ezzel már nagyobb fehérjestruktúrák elhelyezkedését lehet tanulmányozni.

A STORM (stochastic optical reconstruction microscopy) szintén a fluoreszcens festékek egyik speciális tulajdonságát használja ki. Ha a festékmolekulát megfelelő módon világítják meg, akkor ismétlődően be, majd kikapcsol, azaz villog. Ezt a jelenséget a megfelelő szintre beállítva elérhető, hogy a mikroszkóp látóterében található egyedi molekulák egymástól elkülönülve legyenek bekapcsolva. Így az egy időablakon belül érkező fotonokról tudni lehet hogy ugyanaz a molekula bocsájtotta ki. Ugyan a fotonok a kvantummechanika által megszabott szórási szabályok szerint elszórva érkezbek, de ha az ugyanazon molekulából érkező sok foton térbeli helyzetét számítógéppel kiátlagoljuk, 20nm pontossággal azonosíthatjuk a molekulák helyzetét és nagyon pontosan vizsgálhatjuk kölcsönhatásaikat.

Intézetünkben ilyen mikroszkópokat használva azonosították például, hogy a gátlósejtek axonterminálisaiban pontosan hol helyezkednek el a cannabis receptorok, melyek a gátló szinaptikus átvitel hatékony modulátorai.
 

A zölddel jelölt sejtet a cannabis 1-es receptorát hordozó gátlósejt axonterminálisok veszik körül (a). A kinagyított részleten (b) látszik ahogy egy piros axonterminális szinapszist alkot a zöld sejten. Ez a kép mivel "csak" konfokális fluoreszcens mikroszkópiával készült sok részletet nem árul el a cannabis receptorok eloszlásáról. Ha ugyanazt az axonvégződést STORM mikroszkópban vizsgáljuk (c) jól kivehetők az egyes cannabis receptor molekulák (lila pontok) és az is, hogyan helyezkednek el a szinapszishoz képest, melynek helyzetét türkiz pontok jelzik.

Hogy merre lehet még a felbontásban (nagyításban) továbbmenni azt az elektronmikroszkópokról szóló bejegyzésünkben tudhatjátok meg.

Ugyan az anatómia fegyvertárából az elektronmikroszkópokat még nem tárgyaltuk, de a változatosság kedvéért kóstoljunk bele az élettan módszereibe is. Mivel az idegsejtek elektromos jeleket használnak, az agyműködés meghatározó kutatómódszere az elektrofiziológia. Bemelegítésként tehát vegyük is át, hogy milyen módszerek használ, és melyikkel mit tudhatunk meg az agyműködésről?

Kezdjük egy hasonlattal. Intézetünk a Klinikák metróállomásnál található, nem messze a Nagyvárad tér és a Népliget között tornyosodó futball stadiontól. Meccsnapon, az intézet ablakából hallható, hogy körülbelül mikor kezdődik a meccs, a rendőrség szirénázásából és az akadozó forgalom zajából. Ha elmegyünk metróval a Nagyvárad térre, akkor azt is sejthetjük a zajokból, hogy már elkezdődött-e a meccs vagy már esetleg véget ért, illetve, hogy mely csapatok játszanak aznap. Ha odamegyünk a stadion bejáratához, akkor a kiabálás ritmusából sejteni lehet, hogy szabálytalanság történt-e, adtak-e erre szabadrúgást, esetleg gólt rúgott valaki. Ha bemegyünk a stadionba hallhatjuk melyik csapat szurkolótábora hol van, mikor melyik szurkolótábor ordít. Végül, ha felmegyünk a lelátóra és leülünk egy szimpatikus embertársunk mellé hallhatjuk azt, hogyan gyalázza a bírót vagy lelkesíti választott csapata játékosait. Egész távolról csak a tömeg moraját halljuk és közös viselkedésükről sejthetünk valamit. Ahogy közelebb megyünk egyre többet tudunk meg egyre kevesebb emberről, a végén ugye csak azt halljuk, amit a mellettünk ülő vokalizál, de annak minden szavát kivehetjük.

Az elektrofiziológia szivárványának módszerei is ezen a „keveset sokról – sokat kevésről” skálán mozognak. A fejtetőre helyezett EEG elektródák az agyunkban található milliárdnyi idegsejt elektromos zajának koponyacsonton, fejbőrön és egy kis hajon átszivárgott, térben és időben elmosódott átlagát mérik. Az idegsejtek 100mV-os jelei mire az EEG elektródáig elszivárognak, csak 2-3µV-os, viszonylag lassú (alacsony frekvenciájú, < 100Hz) hullámokként jelentkeznek. Bár a jelek csak arról adnak hírt, hogy milyen közös aktivitást mutatnak a sejtek, mióta Hans Berger 1924-ben az első EEG jeleket elvezette sokat megtudtunk segítségükkel az agyműködésről. Kiderült, hogy az ébrenlét és alvás egyes fázisaiban az agy máshogy működhet, hiszen más típusú EEG jeleket lehet róla elvezetni.

A klasszikus EEG a közel egy évszázad alatt sokat fejlődött. A mai EEG sapkákról a modern jelfeldolgozó eljárásokkal már 128-256 csatornán lehet jeleket elvezetni. Ez lehetővé teszi, hogy az agy különböző területei fölül elvezethető EEG jelek közötti összefüggéseket vizsgálhassuk. Ezek a vizsgálatok kimutatták, hogy az agy egyes területei pontosan meghatározott tér és időbeli mintázatban kapcsolnak át a különböző EEG mintázatok között a kísérleti alany által végzett feladatok fázisaihoz kapcsolódóan. Azonosítani lehetett számos agyi funkció helyét, hiszen más területen látható EEG változás fény, zaj vagy mechanikai inger hatására.

Finomabb felbontású EEG jelek elvezetéséhez az elektródákat a koponyacsont alá a kemény agyhártya felszínére (epidurális EEG) kell elhelyezni. Értelemszerűen ezt már egészséges emberekben nem teszik meg. Ilyen típusú vizsgálatokat leggyakrabban epilepsziás betegeken végeznek, hogy behatárolhassák az epilepsziás területet. Ezeket az invazív (műtétet igénylő) módszereket leginkább a kutatók használják kísérleti állatok agyműködésének vizsgálatára. Egy így elhelyezett elektródára érkező jeleket már nem csökkenti a koponyacsont és a fejbőr, azaz az elektróda közelében elhelyezkedő agyterületekről már erősebb és nagyobb frekvenciájú jelek vezethetők el. Ezzel a módszerrel jónéhány milliméteres felbontásban vizsgálható az agyműködés. Ebben az esetben is lehet persze elektródasort vagy rácsot használni a felbontás növelésére.

A következő lépés újabb beavatkozást igényel, a keményagyhártya (subdurális EEG) alá, az agy felszínére lehet elektródákat elhelyezni, ezzel tovább javul a felbontás, de nő a fertőzés veszélye. A következő lépéssel már egészen az idegsejtek közelébe juthatunk.

Itt az agykéregbe szúrt vékony tűelektródát vagy elektróda fésűt használunk, mellyel 1-1024 vagy még több csatornán tudunk jeleket elvezetni. Emberek esetében ezt a megoldást egy feltárt epilepsziagóc milliméter szintű azonosítására használják műtét előtt. Az állatkísérletekben viszont ez az egyik legtöbb adatot nyújtó módszer. Itt ugyanis már annyira közel vagyunk az idegsejtekhez, hogy 100 µV-os jeleket lehet elvezetni egészen 6000 Hz-es frekvenciáig. Egy ilyen jelből, ha az alacsonyabb frekvenciákat vizsgáljuk, akkor a sejtekre érkező szinaptikus áramok összességéről, azaz bemenetükről vonhatunk le következtetéseket, ha csak a jelek gyorsabb alkotóelemeit engedjük át, a sejtek gyors akciós potenciáljait, azaz kimeneti jeleit csíphetjük el. Elektródasor használatával az agykéreg egyes rétegeiben történő jeláramlást és számos idesejt aktivitását azonosíthatjuk. Ezt az elvezetési módot mikroelektródás mezőpotenciál elvezetésnek (angolul LFP= local field potential) nevezzük.

Ha elektródáink kellően sűrűn helyezkednek el, akkor egy-egy idegsejt jele több elektródán is látszik. Ennek egyik változata a tetród, ahol 4 vékony fémszálból csavarnak meg egy elektródasort, hogy egyedi sejteket lehessen azonosítani. Ezeket is össze lehet szerelni elektródasorba, ráadásul úgy, hogy mindegyik tetród helyzete egyedileg, finoman állítható. Mivel a jel erőssége fordítva arányos az elektródától való távolságával, az elektródákon egyszerre megjelenő akciós pontenciál tüskék méretének arányából a sejtek térbeli pozíciója is becsülhető. Ilyen elektróda sorokkal akár több tucat idegsejt működése is azonosítható milliszekundumos pontossággal. Ez az a szint tehát, ahol sejtcsoportok átlag aktivitásának megfigyeléséről átlépünk nagyszámú egyedi sejt aktivitásának a megfigyelésére. Azaz egyre kevesebbről egyre többet tudunk meg.

Mára itt meg is állunk. A következő részben már az egyedi sejtek viselkedését vizsgáló módszereket vesszük sorra.

A hálózatok duruzsolásának kihallgatására alkalmas módszerek után, ma az egyedi idegsejt viselkedését vizsgáló elektrofiziológiai módszerek kerülnek sorra.
A következő lépés az úgynevezett juxtacelluláris elvezetés. Juxta = közeli, azaz a sejtek közvetlen közeléből vezetünk el egy vékony üvegkapillárissal (~0.5µm).

Itt már csak egyetlen sejt aktivitását tudjuk vizsgálni és ha ügyesek vagyunk a vizsgálat végén a sejtet egy jelölőanyaggal a kapillárison keresztül fel is tudjuk tölteni, hogy később megvizsgálhassuk szerkezetét, típusát, összeköttetéseit.

Ha vékony üvegelektródánkat a sejt belsejébe szúrjuk minőségi ugrást hajtunk végre. Ilyenkor már sejtünkön kívül senkit nem hallunk, csak sejtünket, de azt jól. Közvetlenül tudjuk mérni a sejt membránpotenciálját, mely a nyugalmi potenciál -65mV-járól a gátlás -75mV-jára vagy az akciós potenciál csúcsának +15 mV-jára ugrik. Képesek vagyunk a sejtre érkező serkentő és gátló áramokat, valamint a sejt kimenetét, akciós potenciál sorozatait is pontosan mérni. Ezt az elvezetést hegyes elektródás intracelluláris (sejten belüli) elvezetésnek nevezik. A sejtek jelölése és azonosítása itt is elvégezhető. Elektrofiziológiai módszereink sorában ez az a lépés amikor a lelátón beszélgetésbe elegyedünk valakivel. Csak róla tudunk meg dolgokat, de sokat.

De ezzel még nem merült ki az elektrofiziológia repertoárja. Ha egy kicsit nagyobb szájátmérőjű (2-3 µm) elektródát használunk, akkor nem lukat szúrunk a sejtbe, hanem rátapadunk és egy jól záró kapcsolaton keresztül hozzáférünk a sejt belsejéhez. Egy ilyen elektródát használva nem csak a sejt membránpotenciálját mérhetjük, hanem ravasz erősítő rendszereket használva a sejtre érkező serkentő és gátló áramokat is elválaszthatjuk egymástól, illetve a sejtek jelintegrációjának szabályait is vizsgálhatjuk. Ezt az elvezetés típust hívják patch-clamp (folt-csapda) elvezetésnek és az áramok mérésére alkalmas módszert voltage-clamp (feszültség csapda) módszernek.
De még innen is van tovább. Ha elektródánkkal a sejt egy általunk kiválasztott részéhez tapadunk, majd azt leszakítjuk róla akkor az elektródához tapadt sejthártya darabban található ioncsatorna molekulákon keresztül folyó áramok tulajdonságait tanulmányozhatjuk. Így feltérképezhető, hogy az idegsejtek különböző részein milyen tulajdonságokkal rendelkező feszültség vagy átvivőanyag érzékeny molekulák találhatók. Ez a sokat kevésről vége a spektrumnak. Itt az egyetlen molekulán átfolyó áramok tulajdonságait vizsgálhatjuk és ezáltal a molekula működéséről vonhatunk le következtetéseket. Illetve felderíthetjük, hogy a sejtek felszínének eltérő részein (dendrit, sejttest, axon) milyen, a jelterjedésben és jelösszegződésben fontos molekulákból mennyi és milyen tulajdonságokkal található.

A mikroelektródás elvezetéseket gyakran nem élő, szabadon mozgó állatokból végzik, hiszen igen nehéz a mikrométeres sejtet és az elektródát egymáshoz képest rögzítve tartani egy mozgó kísérleti állat esetében. Megoldásként kidolgozták az In vitro (üvegben) elektrofiziológia módzsereit, ahol a vizsgált agyterüleből készített szeleteket tartanak életben megfelelő oldatokkal és ezek sejtjeiből vezetnek el egy vagy több mikroelektródával (bővebben lásd később).

A módszereknek azonban csak egyik része az, hogy milyen elektródákat használunk, a másik az, hogy a jeleket milyen módszerekkel dolgozzuk fel. Az EEG jeleket frekvenciájuk szerint szétválogathatjuk. Ha több csatornánk van megnézhetjük, hogy ezek térben és időben hogyan függenek össze. Ha egy gyors feladatot adunk a kísérleti alanynak vagy elektromosan ingereljük az agyat megnézhetjük milyen időzítéssel és milyen lépcsőkben terjed az ingerület, mik a feldolgozás lépései. Ha nagyon sok csatornánk van, matematikusok és fizikusok által fejlesztett bonyolult statisztikai és jelfeldolgozási módszereket használunk. Nézhetünk összefüggéseket (korrelációk), nézhetjük a jelek mennyire egyszerre változnak (koherencia), de megnézhetjük a közös vagy eltérő információtartalmat és ezáltal a feltételezett kölcsönhatások irányát is becsülhetjük. A módszerek között ma már ismerősként köszöntik a gépi tanulást és a mesterséges neuronhálózatokat.

Egy másik módszert használva, a Mikroelektróda soros elvezetések esetében, ha az egymás melletti csatornák feszültségváltozásának változását kiszámítjuk megkaphatjuk azt, hogy mely agyi rétegekbe érkeznek serkentő vagy gátló áramok és ezeknek mi az időzítése. Ha a jel alacsony és magas frekvenciájú alkotóelemeinek összefüggését vizsgáljuk becsülhetjük, hogy az idegsejtek a rájuk érkező szinaptikus áramokat hogyan alakítják akciós potenciálokká, hogyan dolgozzák fel az információt.

Az eltérő típusú módszereket kombinálhatjuk is. Ha a hálózat átlag viselkedését vizsgáló EEG-mezőpotenciál módszereket egyedi sejtek viselkedését megfigyelő módszerekkel (intracelluláris, patch clamp, multiunit) módszerekkel kombináljuk arról vonhatunk le következtetéseket, hogy az egyes azonosított sejtek hogyan járulnak hozzá a hálózat működésének alakításához. Azonosított sejtek esetében megtudhatjuk az egyes sejtek a csoport többi tagjához képest mikor működnek.

A továbbiakban részletesen beszélünk majd ezekről az elvezetési és elemző módszerekről. Addig is, ha bármi az eszetekbe jut kérdezzetek a szurkeallomany@koki.hu email címen!

Egy idegsejt ~20000 szinapszison keresztül kap jeleket, melyeket a dendritjein folyó elektromos áramokká alakítja. Az idegsejtekben a jelösszegzés során ezen kívül még további ionáramok alakulnak ki, melyek a jelerősítésben vagy ha szükséges jelgyengítésben, finomításban játszanak szerepet.

Tehát már egyetlen idegsejt esetében többezer helyen folyik pozitív vagy negatív áram annak felszínén keresztül a sejt belseje vagy a sejtek közötti tér (extracelluláris tér) felé. Ezt a sziporkázást leginkább a minden órában szikrázni kezdő Eiffel toronyról készült videó  szemlélteti. Csak hát egy idegsejt egymilliomod akkora és a villogás sebessége pedig 10x gyorsabb. Ráadásul agyunkban milliárdnyi Eiffel torony villog.

Ehhez jön még az, hogy az idegsejtek ágasbogas képződmények. A sejtek dendrit és axon rendszere, mint egy tálban a jól összekevert makaróni, hatalmas gubancot alkot. A fizika törvényei szerint az áramok előjelesen összeadódnak, azaz az ellentétes (a sejtbe be, illetve onnan kifolyó) áramok kioltják egymást. Tehát, ha én ebbe a villogó makaróniba beledugom az elektródámat, akkor oda már csak a sokmillió egymást kioltó áramból csak nagyon kevés jut el, az EEG elektródával mérhető feszültség jelentősen kisebb (30-200 µV), mint azok a feszültségek, amiket a sejtek belsejéből mérhetünk (-90 - + 20mV). A rutin EEG-t, mint azt fentebb írtuk, ráadásul nem is a sejtek közül, hanem a fejbőrről vezetik el. A koponya és a bőr ellenállása miatt csökken a jel erőssége (5-10 µV) és a jel nagyfrekvenciás komponensei is eltűnnek. Olyan mintha a villogó tál makarónit 100 méterről néznénk, az egyedi fényes felvillanások messziről egy kicsit bizsergő szürke derengésként látszanak.

Ezen apró jelek érzékelését az elektromos és mágneses zajok szinte lehetetlenné teszik. Nem csoda, hogy az elektrofiziológusoknak mindent meg kell tenniük azért, hogy ezektől az elektromos hálózatból, villanymotoroktól, szikrázó kapcsolóktól mérési eszközeiket és kísérleti alanyaikat minél jobban elválasszák. Egyrészt fémhálóból készült ketrecekben (Faraday-kalitka) dolgoznak, mivel ez (többé kevésbé) felfogja az elektromágneses zavarokat. Igazi ketrecharcosok! Másrészt bonyolult, csak a mérési rendszerekhez tartozó elektromos földeléseket építenek. Egy EEG labort gyakran már úgy építenek, hogy a falakba építik ezeket a fémhálókat. Amíg az öregasszonyok recepteket cserélnek és a Manyi néniről pletykálkodnak, amikor az elektrofiziológusok összejönnek hamar a zajszűrés és földelés rejtelmeire és babonaságaira terelődik a szó.

Hogy mégis képesek vagyunk elektromos jeleket elvezetni az agyból, két dolognak köszönhető. Egyrészt, ha a sejtek rendezetten helyezkednek el, azaz mint például az agykéregben rétegekbe szerveződnek és hasonló irányokba futnak a nyúlványaik, akkor nem teljesen kioltják, hanem részben erősítik egymás elektromos jeleit. Másrészt, ha a sejtek nem egymástól függetlenül, hanem összehangoltan működnek akkor szintén erősödik a jel. Tehát az EEG jelek kialakulásához mind a térbeli, mind az időbeli rendezettség szükséges.

Igaz az egyes sejtek működése millisecundumonként (a másodperc ezredrésze) változik, együttes működésükben megfigyelhetők lassú ritmusok. Ezeket figyelhetjük meg az alfa, béta, delta, gamma hullámokként. A jelenség a vastapshoz hasonlít, amíg a nézők saját ritmusukban tapsolnak csak egy egyenletes zajt hallunk, ahogy elkezdenek egymáshoz igazodni (szinkronizálódni) kialakul a jól hallható, erős taps.

A fentiek miatt csak az agykéreg aktivitása figyelhető meg EEG-vel, mivel az agykérget és még néhány kisebb agyterületet (colliculus superior) leszámítva az idegsejtek egymásba fonódó, minden irányba futó nyúlványrendszerrel rendelkeznek. Fontos agyi struktúrákból, mint például a talamusz, a striátum, a hipotalamusz és az agytörzs nem jut el értékelhető EEG jel a koponya felszínére. Igaz a kisagy is réteges szerkezetű, de tekervényei olyan aprók és sűrűk, hogy a rendezett kisagyi sejtekből származó jelek milliméter szinten kioltják egymást, így a kisagy sem generál értékelhető EEG jelet. Persze mikroelektródákkal ezekről a területekről is el elehet vezetni elektromos jeleket a sejtek közül, de ez elsősorban az idegsejtek akciós potenciáljaiból áll, azaz a sejtek kimenetét mutatja, a rájuk érkező szinaptikus áramokat, melyek a beérkező információt jelzik, nem lehet jól elkülöníteni.

No persze a tudomány itt is kijátszotta a fizikát. Létezik egy MEG, Magneto EncaphaloGráfia nevezetű módszer, ahol az agyi áramok által keltett elektromágneses tereket mérik. Mivel a mágneses tér szabadon áthatol az idegszöveten és a koponyán, ezért a mélyebb agyi struktúrák működése is vizsgálható ilyen módon…. valamelyest. Mert a mágneses térre is igaz, hogyha az áramok kioltják egymást, tehát a mágneses tér is gyenge lesz, másrészt a MEG detektorait folyékony héliummal kell hűteni, emiatt a szerkezet babrás és egy giga méretű, fodrász-szalonban található hajszárítóra hasonlít.

Az #agyseta rovat háttérbe szorult mostanában, de szükség van további technikai alapozásra egy hamarosan bemutatandó cikkhez. Hogy adjunk egy barackot a virtuális élménynek, ma az agykutatók fegyvertárának egyik legújabb és legnagyobb ágyúját mutatom be, az Optogenetikai módszereket.

Ahhoz, hogy valamit meg lehessen figyelni, két dolog kell: egy látható vagy láthatóvá tett objektum, illetve egy ennek megfigyelésére alkalmas rendszer.
 
Az optogenetikai módszerek mind a láthatóvá tétel, mind a megfigyelés oldalán komoly fejlesztések eredményeiként álltak elő.
Korábban már írtunk a fluoreszcen immunfestésről és a fluoreszcens mikroszkópia előnyeiről (kontrasztosabb kép, jobb feloldású kép, egyszerre több anyag vizsgálható eltérő színekben). Három kutatónak (Roger Y. Tsien, Osamu Shimomura, Martin Chalfie) az a ravasz ötletet támadt, hogy az Aequorea victoria tengeri medúza genomjában megkeresse azt a gént, mely egy zölden fluoreszkáló fehérjét, a GFP-t (green fluorescent protein) kódolja, és ezt beültesse más élőlények genomjában, hogy azok is kifejezzék azt, és ezáltal fluoreszcens fényt bocsájtsanak ki.

Az, hogy egy egész állat világít annak a látványosságon kívül nem sok haszna lenne (bár jól mutat a Disco-ban az ember vállán a zölden világító patkány). A nagy húzás az volt, hogy megoldották, a GFP csak bizonyos sejtekben, bizonyos időben, vagy csak a sejtek bizonyos részén jelenjen meg. Ennek alapja az, hogy a fehérjéket kódoló DNS szakaszokról csak akkor íródik át mRNS és erről majd fehérje, ha a gén előtt (időnként csak környezetében) található szabályozó DNS szakaszokhoz (promoterek, enhancerek) hozzákötődnek bizonyos, ezekre a szakaszokra érzékeny transzkripciós faktorok (szabályozó fehérjék). Azt, hogy egy sejtben egy adott pillanatban mely transzkripciós faktorok (TF) vannak jelen azt a sejt fejlődéstörténete határozza meg. Az egyes szöveteket alkotó sejttípusok más TF készletet fejeznek ki, ezek szabják meg működésüket, azáltal, hogy egyedi fehérjék termelését indítják be. Ha például tudjuk azt, hogy a serkentő sejtekben jelen levő transzkripciós faktorok mely promotereket aktiválják (melyik promoterhez tartozó fehérje jellegzetes a sejttípusra), akkor, ha ezt a promotert izoláljuk és utána kötjük az GFP kódját, lesz egy eszközünk arra, hogy egy állat agyában az általunk választott sejteket világítóvá tegyük.

De hogyan tudunk egy új gént behackelni egy állatba? Hát a jól bevált (de még nem részletezett) transzgénikus technológiákat használva. Röviden: elkészítjük a megfelelő promoter+GFP DNS szakaszt, ezt baktériumokban megsokszorozzuk, a DNS-t megtermékenyített petesejt sejtmagjába fecskendezzük (bolhapatkolás felsőfokom) és a petesejtet egy anyaegér méhébe ültetjük. Ezután reménykedünk, hogy a DNS valahova beépül a genomba és amikor a petesejt elkezd osztódni és felépíteni a fejlődő embriót akkor minden sejtben jelen lesz. Ha ez sikerült (gyakran nem sikerül elsőre), akkor azok a sejtek, amikben a megfelelő transzkripciós faktor megjelenik elkezdenek EGF-t kifejezni és zölden világítani, amikor kék fény esik rájuk. Mi pedig boldogan nézegethetjük hol és milyen alakú sejtek vannak az agyban. No persze a megfelelő mikroszkóppal.
Ha viszont arra vagyunk kíváncsiak, hogy egy bizonyos fehérje hogyan mozog a sejtben és hol helyezkedik el, egy ravaszabb trükkhöz kell folyamodnunk. Egy kiméra fehérjét kell csinálnunk. Ugye a kiméra az a tűzokádó mitikus állat, aminek oroszlán teste és kecske feje volt, farka helyén pedig egy kígyó tekergett. Nos nekünk egy olyan fehérjét kell összerakni, amiben az eredeti, vizsgálni kívánt fehérje szabályozó és kódoló DNS szakaszába még a GFP kódját is beszúrjuk. Ha ez megvan jöhet a fenti petesejtbe ültetés és várás. Ez még babrásabb, mint az előző módszer, mert sok fehérje elveszti működőképességét, ha más fehérjéket lógatnak rá, de azért van rá esély, hogy ha nem is elsőre. de működik a dolog. A kutatóintézetek manapság több tucat egérvonallal rendelkeznek, melyek bizonyos sejttípusaikban fejeznek ki világító fehérjéket. Ezeket a vonalak keresztezve többszörös világító egereket nyerhetünk, a megfelelő kérdések megválaszolására.

A fehérjék sejtekbe juttatásának egy másik módszere, hogy a géneket becsomagoljuk egy vírusba, melyet az agyba juttatva megfertőzzük a célsejteket és azok kifejezik a kívánt fehérjét. Ez egyszerűbb és gyorsabb, mint egy transzgénikus egérvonal előállítása, de mivel a géneket kifejlett állat testének egy pontjára juttatjuk, azok nem kerülnek be az ivarsejtekbe. Azaz, az állat az utódainak nem adja tovább őket, azaz ez egy egyedi megoldás, az állatokat minden alkalommal meg kell jelölni a vírusok segítségével. Viszont rugalmas, mivel a mélyhűtőben tárolt, különböző gének bejuttatására alkalmas vírusvonalakat mint festékeket lehet használni, akár több különböző hatásút kombinálva. A vírusok felhasználásáról írunk majd még bővebben. A lényeg az, hogy az óvatosság kedvéért itt genetikailag megváltoztatott vírusokat használunk, melyek nem alkalmasak szaporodásra, csak egyszeres fertőzésre.

A GFP ötletért a 3 kutató 2008ban Nobel díjat kapott, mert addigra már továbbfejlesztett alapeszközzé vált a fluoreszcens fehérjék használata. Az eredeti fehérje szerkezetének finom módosításával előállítottak további színű floureszkáló fehérjéket, ezáltal mint a többszörös immunfestés esetében több sejttípust és a közöttük levő kapcsolatokat vagy fehérjék egymáshoz képest való elhelyezkedését is vizsgálni lehet.

Mint a felvezető fejezetekben írtam egy összetett rendszer megismerésének első két lépése az elemek azonosítása és az elemek közötti kapcsolatok azonosítása. Ezt követi az elemek működésének és a köztük levő kölcsönhatásoknak a felderítése. Az FP-k használata a struktúrák azonosításában és a kapcsolatrendszerek felderítésében hasznos. De itt nem állt meg az optogenetika. A továbblépést egy további fehérjecsalád, valamint egy ravasz kiméra fehérje használata hozta.

Mikrobákból izoláltak olyan fehérjéket, melyek fény hatására ionokat engednek át (vagy aktívan pumpálnak át) a sejthártyán. A channelrhodopsin nevezetű fehérje fény hatására pozitív ionokat (kationokat) enged a sejtbe, ezáltal depolarizája, azaz serkenti azt. A halorhodopsin negatív ionokat (Cl^-) enged a sejtbe, ezáltal hiperpolarizálja, azaz gátolja a sejtek működését. Megfelelő sejtekben kifejezve ezeket a fehérjéket és a szükséges hullámhosszúságú fényt használva sejtcsoportok működését tudjuk befolyásolni, a sejtek aktivitását növelni, vagy csökkenteni. Ráadásul a két fehérje más színű fényre érzékeny. Kék fénnyel a serkentő channelrhodopsin-t, sárga fénnyel a gátló halorhodopsint lehet bekapcsolni. Ez lehetővé teszi, hogy kombinációban használjuk a két fehérjét, összetett kísérleti felállásokat megvalósítva. A fiziológus tehát már képes arra, hogy sejteket aktiváljon és kölcsönhatásaikat vizsgálja ha a megfelelő opszint (a fehérjecsalád összefoglaló neve) használja.

Nézzük a másik oldalt. Az ember mindig többre vágyik. Az elektrofiziológus is ember, ezért Ő is többre vágyik. Reggel kávézás közben azon sóhajtozik: „Az igazi az lenne, ha úgy tudnám a sejtek működését, sok sejt működését vizsgálni, hogy ne kelljen ehhez mikroelektródám végére szúrni őket!” Hát ez a vágyuk is teljesült egy másik ravaszkodás keretében. Itt egy Ca²⁺ érzékeny fehérjét kapcsoltak a korábbról ismert GFP molekulához, előállítva a GCaMP nevű sztárfehérjét. A fehérjék működésében meghatározó, hogy a fehérjelánc hogyan tekeredik fel 3Dben. Ha a szerkezetük torzul nem, vagy másképp működnek. Ilyen balesetet már biztos mindenki látott túróvá csapódott savanyú tej vagy főtt tojás formájában. A savanyodó tejben megváltozik a kémhatás, amitől a korábban oldékony kazein fehérjék megtekerednek és ezután egymáshoz tapadva kicsapódnak. A főtt tojás esetében a magas hőmérséklet hatására tekerednek olyan alakba az albumin molekulák, hogy összeállnak kemény fehér zselévé. Nos, a GCaMP egyik fele képes arra, hogy Ca²⁺ ionokat kössön meg. Amikor megköt egy vagy több Ca²⁺ iont akkor ennek hatására megtekeredik, de mivel egybe van építve egy GFP molekulával azt is megcsavarja.

Ez megváltoztatja a GFP molekula által kibocsájtott fény hullámhosszát és megfelelő hullámhosszon mérve a fluoreszcencia felerősödését lehet megfigyelni. Ezzel a trükkel képesek vagyunk arra, hogy fényjelekké alakítsuk a sejtben megfigyelt Ca²⁺ ingadozást. Szerencsére az a kellemes helyzet, hogy amikor egy idegsejt aktiválódik, depolarizálódik, sok Ca²⁺-ot enged magába, azaz az aktiválódó sejtek a mikroszkópban apró felvillanásokként látszanak. Megfelelő mikroszkópos rendszerrel (lásd a következő bejegyzést) az aktiválódó sejtek villogásáról video felvétel készíthető és ezt elemezve megtudhatjuk, hogy mely sejtek működnek az agy bizonyos állapotában és hogyan hatnak kölcsön. Ha egy sejtet vizsgálunk megtudhatjuk hogyan összegzi a rá érkező jeleket.

A GCaMP egy remek eszköz, de vannak hátrányai. Egyrészt a Ca²⁺ szint lassan változik a sejtekben és így míg az akciós potenciálok 2-3ms hosszúak egy GCamP jel hossza ennek 100x-osa. Másrészt, sok sejtben egyetlen akciós potenciál nem vált ki érzékelhető Ca²⁺ jelet, így nem látjuk minden alkalommal amikor egy sejt megszólal. Arra viszont remekül alkalmas, hogy a dendritekben zajló Ca²⁺ függő jelösszegződési folyamatokat és azok fajtáit azonosítsuk (lásd korábbi cikkünket).

Mennyivel pontosabb lenne, ha egyből a sejthártyán eső potenciált tudnánk mérni!

Látnánk ahogy a beérkező szinaptikus áramok által okozott feszültséghullámok terjednek, kölcsönhatnak, majd akciós potenciált váltanak ki!!! Sokan gondolják ezt, ezért az optogenetikai módszerek aktuális Szent-Grálja a feszültségérzékeny fehérjék fejlesztése. Kicsit olyan a helyzet, mint a magfúzióval, meg a James Webb teleszkóppal volt, azaz, hogy mindig azt mondják már csak évek kérdése és meglesz. De azért közelítünk. Itt nem vagyok napi szinten tájékozott, de azt már látni, hogy a sejthártyába beépült feszültség-érzékeny fehérjék nagyon gyorsan jelzik a sejthártyán eső feszültség értékét, jól követik és jelenítik meg a sejtek aktivitását. Viszont sajnos a jelek gyengék. Egyedi sejteknél még csak derengenek az akciós potenciálok, sok sejt jelének átlaga értékelhető csak. Az egyedi szinaptikus áramokat még nehezebb látni, csak egy erősebb ingerre a sok sejtre beérkező jelek összességét. De hát ne legyünk türelmetlenek. Képzeljük el milyen kicsi az a membrán felszín amire egy szinapszis depolarizáló hatása kiterjed. Ahhoz, hogy használható fotonszám változást mérjünk sok feszültségérzékeny fehérjét kell azon a kicsi helyen kifejezni, azokat meg kell világítani kellő mennyiségű fotonnal és a kibocsájtott alacsonyabb hullámhosszúságú fotonokat mind el kell csípni!

Ehhez nagyon ravasz és igen drága szerkezetek kellenek Ezekkel folytatjuk a következő alkalommal.

Az előzőekben bemutattuk, hogy elő lehet állítani olyan transzgénikus egereket, melyek bizonyos sejtjeikben, azok egy jól meghatározott részén vagy egy meghatározott időben, különböző szintetikus fehérjéket fejeznek ki. Ily módon megjelölhetünk sejteket, fény hatására serkenteni vagy gátolni tudjuk őket, illetve megfigyelhetjük a sejtek működését.

Azért, mert az agyszövetben a fény sokka jobban terjed és kevésbé szóródik, mint az elektromos áram. Így az optika évszázados tapasztalatait használva, mikroszkóppal 3Dben, mikrométeres felbontással látjuk az aktív sejteket és ugyanígy pontosan tudjuk irányítani mi az a terület amit fénnyel ingerlünk.
A GFP-vel, vagy annak továbbfejlesztett (érzékenyebb) változatával az EGFP-vel jelölt sejteket akár egy egyszerű fluoreszcens mikroszkóppal is vizsgálhatjuk. Ez a mikroszkóp alkalmas arra is, hogy több más színű fluoreszcens fehérjét tartalmazó sejtet, és azok kapcsolatát is vizsgáljuk egyszerre. Ha a finomabb nyúlványrendszereket (dendrittüske, axon terminálisok) kívánunk vizsgálni akkor érdemes egy konfokális mikroszkópot használni. Mint korábban írtuk, ebben egyrészt javul a felbontás, másrészt nagyobb hatékonysággal gyűjti be a fotonokat, és ezért érzékenyebb is.

Ha azonban a GCaMP-et vagy feszültség érzékeny fehérjéket kifejező sejtek működését szeretnénk vizsgálni akkor árban egy nagyságrendet kell lépnünk (100-150 millió forint egy ilyen szerkezet) és 2 vagy több foton mikroszkópiát használni. Erre két alapvető indokunk van. Egyrészt, mivel az idegi folyamatok gyorsan, ms skáláján zajlanak, igazából mozit kell készíteni a sejtekről, nem fényképet. Ehhez gyors képalkotó rendszerekre van szükség. Másrészt mivel nagyon nagy fényenergiával kell megvilágítani a mintát a 2 foton hatás kiváltásához, egy adott pontban ezt a fókuszált lézerfénnyel nagyon pontosan és nagy sebességgel kell végig pásztázni a mintát, hogy képet is kapjunk és a mintánkat (ami jó esetben él és működik) se süssük meg. Mitöbb, ha a mintánkban egyszerre minél több sejtet szeretnénk vizsgálni akkor nem csak 2D optikai szeleteket kell vágnunk (ez ugye a konfokális és az ebből fejlődő 2-foton mikroszkópia alapműködése), hanem gyors egymás utánban, egymás feletti szeletek 2D pásztázásával egy 3D képet kell alkotnunk. Ez ugye még finomabb, ravaszabb és gyorsabb rendszereket követel, illetve az elkészült képsorozat (video frekvenciával felvett 3D adathalmaz) hatalmas adatmennyiségét még tárolni és számítógéppel feldolgozni is kell. Cserébe egyszerre több száz, több ezer idegsejt működését vagy egy idegsejt egész nyúlványrendszerének jelintegrációját vagyunk képesek megfigyelni. Lélegzetelállító mozikat lehet készíteni arról,

hogyan kapcsolódnak ki és be sejtek populáció az agy működése közben. Igaz cserébe másodpercentként közel 1 GBnyi adatunk keletkezik, amit majd hosszas és bonyolult számításokkal kell elemeznünk, nagy teljesítményű számítógépek segítségével.
Kezdetben ezeket a rendszereket még csak agyszeletek működésének vizsgálatára használták, mert ezeket lehetett a mikroszkópok alá elhelyezni. De manapság már lassan rutinná válik az a technikai bravúr, hogy élő, éber, sőt szabadon mozgó állatok sejtjeinek viselkedését figyelik meg a feladatok megoldásának különböző fázisaiban.

Ehhez két megközelítés alkalmazható. Az egyik a fejrögzített (head-restrained) módszer. Itt egy műtét során egy kis üvegablakot helyeznek el a koponyacsonton, amin keresztül majd belátnak a mikroszkóppal az agyba, illetve az ablak köré egy apró, stabil koronát rögzítenek a koponyacsonthoz, melynek segítségéve az állat fejét elmozdulás mentesen lehet rögzíteni a mikroszkóphoz képest. A műtét után az állat úgy talál folyadékot és táplálékot, ha a fejét behelyezi a koronát rögzítő kütyübe. Néhány nap alatt megtanulja, hogy ez nem okoz kellemetlenséget és jutalmat is kap itt. Ezek után lehet megkezdeni az idegsejtek működésének megfigyelését. De nem ám akárhogy! Mivel az állat feje rögzítve van nem tudna mozogni, ami előnytelen például egy labirintusban való tájékozódás vizsgálatakor. Ezért az egerek alá egy futószalagot vagy egy levegővel alulról lebegtetett labdát helyeznek, ezen szaladgálhat. Mindeközben mindkét szeme előtt egy-egy monitor van (merthogy az egerek szeme oldalra néz, révén zsákmányállatok) melyen virtuális valóságban tájékozódik.

A másik megoldásban az egerek koponyájára egy miniatűr mikroszkópot építenek, mely a szabadon mozgó állatban is képes a sejtek aktivitását mérni. Ennek felbontása persze nem olyan jó, mint az előző rendszeré, de valóságosabb viselkedést enged meg az állatnak.

Akkor most nézzük a másik oldalt, a sejtek aktivitásának befolyásolását. Ugye az agyszeletek esetében viszonylag könnyű a sejteket fénnyel ingerelni, ahhoz, hogy működésüket befolyásoljuk. A legfapadosabb módszer, hogy egy lézerből érkező üvegszál kábel végét a szelet fölé helyezzük, és a lézer kapcsolgatásával tudjuk a sejteket ingerlő vagy gátló fényt bekapcsolni. Jelentősen finomabb megoldás az, amikor a fluoreszcens mikroszkóp fényútjába vetítik be a lézer sugarat, mert ilyenkor egyedi idegsejteket lehet célzottan aktiválni. Így vizsgálható például az, hogy egyetlen sejt be vagy kikapcsolása milyen hatással van a hálózat többi részére. Ennek a technikának a csúcsa, amikor egy lézer projektor mikro-tükör rácsával vetítünk előre tervezett fénypontokat az idegsejtekre. Így tetszőleges kombinációban aktiválhatók sejtek vagy egy sejt dendritnyúlvány rendszere és a hálózat vagy az idegsejtek jelintegrációja vizsgálható nagyon hatékonyan.

Szabadon mozgó állatok esetében is vannak fokozatok. A legegyszerűbb, hogy a műtét során amikor elektródákat ültetünk az állat agyába és vagy a megfelelő vírusokkal fertőzve opszinokat fejeztetünk ki a megfelelő sejtekkel, egy optikai kábel végét is elhelyezzük a megfelelő agyterületen. Ezen az optikai kábelen keresztül jut a sejteket aktiváló vagy kikapcsoló lézerfény a célterületre. Célunk az, hogy megvizsgálhassuk, hogyan változik meg az állat viselkedése, ha megfelelő időpontban ki vagy bekapcsoljuk az adott agyterületet. Mostanra már a vezető újságokban csak úgy jelenik meg egy fontos eredmény, ha a kutatók szabadon mozgó állatban is bizonyítani tudják, hogy az általuk felfedezett mechanizmus vagy agyterület részt vesz az állat viselkedésének alakításában. Az intézetből 2 cikk is jelent meg a közelmúltban a Science folyóiratban, amelyekben a megfelelő agyterület optogenetikai manipulációjával az állat viselkedésének megváltozását érték el. Az egyik munka azt bizonyította, hogy a mediális raphe mag kulcsfontosságú a negatív élmények rögzülésében. Ha a megfelelő pillanatban elhallgattatták ezt az agyterületet az állat nem emlékezett az őt ért traumára. A másik eredmény szerint a nucleus incertus nevezetű agyterület az egyes helyzetekhez társított félelmi memórianyomok rögzítésében fontos.

De szabadon mozgó állatban is használhatjuk egyedi sejtek be vagy kikapcsolására az optogenetikát. A megfelelő opszinokat kifejező sejtek közé egy olyan mikroelektróda sort ültetünk be, ahol a félvezető technikával előállított apró elektródákon az opszinok aktviválásához szüksége hullámhosszúságú lézerfényt kibocsájtó lézer diódát, vagy diódákat helyeznek el a gyártás során. Ezzel a finom eszközzel több tucat sejt aktivitását lehet megfigyelni, miközben egy vagy több sejtet ingerlünk vagy gátolunk optikaikag. Egy ilyen finom szerkentyűn 1-4-8-16 elektróda tű található, mindegyiken 1-8-16 elvezető hellyel és az egyes tüskéken lézerdiódákkal. A tüskék 800-1000 µm hosszúak és 20-100 µm vastagok. Nagyon kell rájuk vigyázni, mert rettentően törékenyek és darabjuk 500-1000 dollárba kerül. Viszont hatalmas mennyiségű információ nyerhető velük az agyi hálózatokban zajló folyamatokról. Megtudhatjuk hogyan kódolják a sejtek a környezet információját és egyes sejtek működésének megváltoztatásával megérhetjük hogyan befolyásolják a hálózat működését.
Az utolsó habcsók a tortán, hogy egy állatban egyszerre kifejezhetjük a sejtek működésének vizsgálatát lehetővé tevő GCaMP-et illetve a sejtek működésének optikai szabályozását lehetővé channel- és halo-rodopszinokat. Így fényt használva egyszerre figyelhetjük meg és befolyásolhatjuk az agy működését. A lehetőségeket csak a képzeletünk határolja be.

Te milyen kérdésre szeretnél választ kapni?

Jó agymozizást!

Két nemrég megjelent tudományos cikk magyarázatához következik egy kis technikai alapozás. A két cikkben az a közös, hogy mindkettő a Rózsa Balázs vezette Neuronhálózat és Dentritikus Aktivitás Kutatócsoport laboratóriumban készült és saját fejlesztésű, az agyi aktivitás vizsgálatában úttörő technikai újításokat használó 2-foton mikroszkópokat használt.

Mi is a labor által fejlesztett mikroszkópok erőssége? Ugye a gamer egerek bejegyzésben írtunk az idegsejtek működését 3D moziként vizsgálni képes 2-foton mikroszkópokról, melyek a GCaMP optogenetikai fehérje idegsejt aktivitást jelző fluoreszcenciáját vizsgálják. Egy alap 2-foton mikroszkóp úgy állítja elő a 3D képet, hogy egymást követő szeletekként (2D) végigpásztázza az agy vizsgált térfogatát. Ehhez egyrészt két rezgő tükröt használ, melyek mozgatásával egymást követő sorokban lehet pásztázni a szövetet, majd a mikroszkóp fókuszának finom léptetésével egy következő szintet pásztáz.

Valahogy úgy kell elképzelni ezt a képalkotást, mint mikor egy olvasó kisgyerek ujját végigvezeti egy könyv sorain, majd egy következő lapra lapoz. Így a 3D pásztázás egy viszonylag lassú folyamat, hiszen a tükrök, még ha aprók is, tömeggel rendelkeznek, nem végtelen sebességgel mozognak. A fókusz léptetés még nagyobb tömegek lassú mozgatásával jár.

A másik probléma, hogy még ha nem is vagyunk kíváncsiak minden egyes pont aktivitására, akkor is végig kell vezetnünk a pásztázó pontot az egész térfogaton. Ahhoz, hogy kellő mennyiségű fotont (fényt) tudjunk begyűjteni a megfelelő jel-zaj szinthez, minden ponton el kell tölteni egy kis időt. Sok kicsi sokra megy és emiatt a következő pásztázást csak az előző befejezése után tehetjük meg, azaz ugyanazt a pontot csak hosszú idő múlva tudjuk újra mérni, azaz alacsony lesz a mintavétel frekvenciája. Képzeljük el mennyi ideig tart egy beszélgetés a futó és edzője között, ha a futó minden 200 méter lefutása alatt edzője mellett elfutva csak néhány szót tud mondani. Vagy ha edzője folyamatosan beszél mit hall belőle egy-egy körben.

Balázsék azt a feladatot oldották meg, hogyan lehet egyszerre sok idegsejtből, vagy egyetlen idegsejt dendritágairól, az élettani vizsgálatokhoz szükséges nagy gyakorisággal (frekvenciával, másodpercenként 10-50 szer) mintát venni. Sok sejt mintavételezésére azért van szükség, hogy megtudhassuk az agyban a feladatok megoldása során az idegsejtek aktivitásmintázata hogyan kódolja és dolgozza fel az információt.

A dendritek vizsgálata pedig abban segít, hogy a sejtek hogyan összegzik a rájuk érkező jeleket és hogyan alakul aktivitásuk.
A fejlesztő kutatóknak azt kellett megoldaniuk, hogy a minta közel tetszőleges pontjai között tudjanak nagy sebességgel mozogni, így kihagyhatják a közbeeső, jelentős méretű, felesleges területről a lassú foton gyűjtögetést és gyorsan újra visszatérhetnek a kívánt terület új mintavételezésére.

Ehhez két dolgot kellett megoldaniuk: 1) 2D-ben gyorsabban tudják tetszőleges helyre mozgatni a tükrüket, illetve 2) gyorsan tudjanak különböző mélységekbe fókuszálni a mikroszkóp nehéz alkotóelemeinek mozgatása nélkül. Az első feladatot elektronmágnessel mozgatható apró tükrök ravaszul leprogramozott mozgatásával oldották meg. A másik megoldás még ravaszabb volt, az akuszto-optikát hívták segítségül. Mi is ez?

Biztos mindenki látott már olyan videót, ahol egy fémlemezre szórt homok különböző magasságú hangok hatására más-más mintázatba rendeződik. Itt ugye az történi, hogy a hangtól a lemez rezgésbe jön, hanghullámok terjednek benne. Bizonyos frekvenciákon úgy hullámzik, hogy egyes pontjainak kitérése a lehető legnagyobb, viszont más pontjai nem mozdulnak el. A homok ezeken a pontokon halmozódik fel. A megfelelő frekvenciákat saját frekvenciáknak nevezik és ezeken a lemezen egyedi mintázatok jelennek meg. Ez volt az akuszto- (azaz hang) része az akuszto-optikának.

De mi az optika belőle? Ugye egy mikroszkópban bonyolult lencserendszer alkotja a képet. A lencsék úgy működnek, hogy mivel az üvegben a fény más sebességgel terjed, mint a levegőben, amikor a fénysugár eléri a meggörbült lencsét elkanyarodik, fókuszálódik vagy szóródik a lencse alakjától függően. Azt, hogy mennyire kanyarodik el, a lencse törésmutatója (a levegőben és az üvegben terjedő fénysebesség hányadosa), illetve a lencse alakja határozza meg. Minél jobban lelassul a fény (nagy törésmutató) és minél görbültebb a lencse felülete, annál jobban téríti el a fényt. No ez az optika.

És hogy jön össze a kettő? Akár hiszitek akár nem az üveg is rugalmas, azaz, ha megfelelő frekvenciával rezgetjük akkor, mint a fenti példában a fémlemez, képes megváltoztatni az alakját. Ráadásul a terjedő hanghullámok még az üveg kristályszerkezetét is megváltoztatják egy kicsit (összenyomják vagy ritkítják), megváltozik sűrűsége és ezért a fény terjedési sebessége is, megváltoztatva a törésmutatót. Tehát ha a mikroszkóp egyik optikai elemét megfelelően ravasz módon rezgetjük, akkor képesek vagyunk a terjedő fény irányát és ezáltal a fókuszált fény mélységét befolyásolni, anélkül, hogy az egész nehéz miskulanciát kelljen mozgatni. A kérdés már csak az, hogyan tudjuk az optikai elemet rezgetni?

Nem kell azt elképzelni, hogy egy hatalmas JBL-t helyezünk a mikroszkóp mellé. Ez több ok miatt nem működne, egyrészt nem lenne elég hangos, másrészt igaz, hogy egy jó hangfal 25-25000 Hz-ig visz át. Ez nekünk itt nem elég. A pici elemek rezgetéséhez magas ultrahang frekvenciákat kell használni 100kHz magasságában. Szerencsére erre is van megoldás. Léteznek olyan kristályok, melyekre, ha nagyfrekvenciás feszültséget kapcsolunk akkor a feszültség frekvenciájával megegyező frekvenciával elmozdul, vagy fordítva, ha rezgetjük a felszínéről ilyen frekvenciájú feszültségingadozást lehet mérni. Ezeket a kristályokat hívják piezoelektromos anyagoknak és a jelenséget piezoelektromosságnak. Ilyennel már biztos mindenki találkozott, ha nem is tud róla, hiszen mobiltelefonjaink mikrofonjai és hangszórói ily módon működnek (nem is beszélve a bennük levő gyorsulás és szögelfordulás érzékelőkről).

Egy ilyen rendszer persze nem csak a mikroszkóp mechanikájából áll, hanem egy összetett számítógép vezérlést is fejleszteni kellett hozzá. Egyrészt a leképző lézersugár mozgatásához, fókuszálásához a közel tetszőlegesen kanyargó útvonalon, másrészt a nagy sebességű adatgyűjtéshez, az adatok megjelenítéséhez és elemzéséhez.

Egy 3D képalkotó mikroszkóp vezérlő programja.

A fejlesztők szuper mikroszkópjukat Hullámvasút mikroszkópnak (roller coaster microscope) nevezték el, mivel közel tetszőleges görbült útvonalon tudják végigvezetni a lézersugarat és ezzel mérni egyedei sejtek nyúlványrendszerének viselkedését, vagy több tucat, egymás közelében elhelyezkedő idegsejt működését. És ami a lényeg, nagy frekvenciával, másodpercenként több tucatszor. A fejlesztés sok évig tartott, még most is folytatódik, és annyira jól sikerült, hogy egy spin-off cég is született jelentős pályázati sikerekkel. A cégben biológusok, fizikusok, matematikusok, programozók és mérnökök dolgoznak együtt és a fejlesztésekbe már a különböző területek egyetemi hallgatóit, doktoranduszait is bevonják. A cég világszerte szállítja keresett termékét az idegtudósok számára.

Amikor áttekintettük az elektrofiziológiai módszerek szivárványát, valahol középtájt (a koponyatetőről elvezetett EEG és az egyedi ioncsatornákból elvezetett áramok között) szó volt a sokelektródás mező elvezetésekről (local field potential recording). Itt ugye vékony elektródákat juttatunk az agyszövetbe az idegsejtek közé és a sejtek által a külvilágba leadott áramokat csípjük el.

Az elvezetett elektromos jelek eltérő frekvenciájú (sebességű) alkotóelemekből állnak, melyeket megfelelő módszerekkel (digitális vagy elektromos szűrőkkel) el lehet választani egymástól. Szemléltetésként képzeljük el a Dunát, amin egy hajó elhaladásakor lassú nagy hullámok alakulnak ki és terjednek, de ha egy csuka a kis halak közé csap akkor a nagy hullámok felszínén apró pici fodrok jelzik a menekülő kis halakat. Egy vidra vagy egy fóka a bajusszálaival képes ezeknek a víz alatt is terjedő, eltérő hullámhosszúságok hullámoknak az érzékelésére. Mint ahogy ők is képesek elkülöníteni a halak által keltett gyors rezgéseket a víz hullámzása vagy áramlása miatt keletkező lassú ingadozásoktól, az elektrofiziológusok is képesek arra, hogy elemeire bontsák az elektromos jeleket. Ez azért fontos, mert a lassú összetevők sok sejt átlag aktivitásáról adnak információt, a gyors komponensek pedig a működő sejtek által kibocsájtott akciós potenciálokról, azaz az éppen működő sejtekről árulnak el dolgokat.

Az egyedi sejtek működésének elcsípésére szolgáló módszert (elektróda, szűrés és elemzés) nevezik unit (egység) elvezetésnek.

Ez idáig egyszerűen hangzik, de az elektrofiziológusok egyszerre minél több idegsejt működését szeretnék azonosítani, hiszen az agyi információt az idegsejtek működésének mintázata hordozza.

A feladatot ahhoz hasonlíthatjuk, mint amikor egy réten, este a sötétben mikrofonokkal felvett hangfelvételek alapján szeretnénk kitalálni, hogy hány birka béget bánatosan a sötétben. A mikrofon ugye csak azt érzékeli, hogy milyen erős hangot vesz fel, illetve mikor, de azt nem tudja merről jön a hang. Elektródáink is így működnek, csak a jel erősségét, az elektródán eső feszültséget képesek mérni, időben pontosan, de azt nem tudják merre van a jelet kibocsájtó sejt. Ha egy mikrofonunk van akkor csak azt tudhatjuk, hogy több birka van, hiszen eltérő erősségű bégetések érkeznek. Az is előfordulhat, hogy több birka ugyanolyan távolságra van és hangjuk ugyanolyan erősen érkezik. Ezt a problémát úgy lehet megoldani, hogy a réten, egymástól távol még egy, vagy eltérő helyeken, még több mikrofont helyezünk el. Így bár az egyik mikrofonon két birka ugyanolyan hangosnak hallatszhat, egy másik mikrofontól eltérő távolságban lesznek és hangjuk erőssége el fog térni.

Azaz, ha egy adott pillanatban érkező bégetések erősségének az arányát megvizsgáljuk, akkor az birkákként egyedi lesz. Jól elhelyezett mikrofonokkal, ha birkák egymástól megfelelő távolságra helyezkednek el, egy réten több tucat birkát tudunk azonosítani. Sőt, ha feltételezzük, hogy a bégetés erőssége arányos a birka távolságával az adott mikrofontól, akkor még a helyzetét is meg tudjuk határozni a mezőn (háromszögeléses módszer). Az elektrofiziológusok pontosan ezt csinálják az agyban is. Olyan sokcsatornás elektródokat használnak, melyek kivezetései egymástól néhány tucat mikronra helyezkednek el és így számos sejt azonosítható (multi-unit, sok-unit elvezetés).

És persze az élőlények is használják ezt a trükköt, hiszen azért van két fülünk, hogy a hang térbeli helyzetét meg tudjuk határozni. Sőt, ha valaki közelebbről megnézi egy macska, egy ember vagy még inkább a denevér fülét, láthatja, hogy azon mindenféle ravasz redők találhatók. Ezek szerepe, hogy még jobban szétválasztják az eltérő irányokból érkező hangokat, mintha nem kettő, hanem négy, hat, vagy nyolc fülünk (mikrofonunk lenne).

Az első ilyen több sejt azonosítására alkalmas elektródát tetródnak nevezték el, mert 4 (görögül tetra) elektród szálat ragasztottak egymás mellé. Sokan még ma is kézzel készítik a 4 darab 10 mikrométeres szigetelt wolfram szálból összesodort apró elektródákat. Ez kézügyességet és nagy türelmet igényel. Fontos az elektród hegyének kialakítása is, mivel minél kisebb annak ellenállása annál erősebben veszi a jeleket. Ezért az elektródakészítéshez az is hozzátartozik, hogy elektromos árammal ellenállást csökkentő aranyréteget választanak ki az elektródák hegyére megfelelő oldatokból. Ugye amikor erősen fülelünk, akkor levesszük a sapkát meg a kapucnit, hogy kisebb legyen a hanghullámok számára az ellenállás.
A sejt és soksejt (unit és multi-unit) elvezetések nagy nehézsége, hogy az elektródák csak körülbelül 50 mikrométer távolságig hallják a sejteket, azaz nagyon pontosan kell őket beállítani. Az agy egy puding állagú szerv, mely egy kemény csontos tokba a koponyába van bezárva. Elektródáinkat valamihez rögzíteni kell, hogy ne mozduljanak el a sejtekhez képest. Erre két módszert használnak. Vagy az állat fejét rögzítik egy kerethez, melyhez az elektróda kapcsolódik, vagy fogászati cement segítségéve egy kis „koronát” építenek a koponyacsontra (altatás alatt) és ehhez rögzítik az elektródákat. Az első esethez altatott állatot használnak és az elvezetés csak néhány óráig tarthat. A fejre épített elektróda tartót (drive) viselő állatból már napokig, jól sikerült, tiszta, pontos műtét esetén hetekig lehet ugyanazon sejtek aktivitását megfigyelni, miközben az állat szabadon mozog. De egy-egy ilyen műtéthez pontos kéz és nagy rutin szükséges, különben az agyszövetet ért károsodások miatt az megduzzad, elmozdul és a nehezen megszerzett sejtek eltűnnek.

Hogy az azonosított sejtek számát növelhessék, a kutatók tetrode kötegeket készítenek, melyekben az egyedi tetródok helyzete az agyon belül a koronára helyezett drive-ban finom csavarokkal állítható és úgy mozgathatók, hogy a sejtekről a legerősebb jeleket lehessen elvezetni. A tetródok nagy előnye, hogy a vékony finom elektródák rugalmasak és együtt mozognak az aggyal, a sejtek elvezetése stabilabb. A tetródok elkészítése bolhapatkolás, sok munkát igényel, cserébe viszonylag olcsók. Sajnos aránylag nagy roncsolást végeznek a szövetben, hiszen egy köteg 100 mikrométer vastag is lehet, illetve rugalmasságuk miatt mélyebben eső agyterületek célbavétele nehéz, mert miközben az agyba hatolnak elhajolhatnak és elkerülik a célterületet.

Az elektródák számának növelésére, a roncsolás csökkentésére és a pontosabb célzásra fejlesztették ki a „silicon probe”-okat, melyeket, mint nevük is sugallja szilikonból készítenek a computer chipek technológiájával. Itt egy 15 mikron vastag és 50 mikron széles alapra építik fel az elektródákat fotolitográfiával. Ennek finom felbontása miatt egy ilyen probe-ra (szondára) 70-150 elektróda is elhelyezhető. A fejlett technológiának persze ára van, egy ilyen elektróda 5-800 dollárba kerül. Katalógusból lehet megrendelni milyen kiosztású elektródasor felel meg igényeinknek, de egyedi elektródákat is tervezhetünk, persze ennek ára jelentősen borsosabb.

A továbbfejlesztett probe-oknak már több ága is lehet egymástól 150 mikrométerre, áganként 128 csatornával és vezető műanyag bevonattal, amely jelentősen csökkenti az elektródák ellenállását és ezáltal javítja az elvezetett jel minőségét, ami több sejt azonosítását teszi lehetővé. Ezek a kütyük már akár 2000 dollárba is belekerülhetnek.

Figyelemre méltó újdonság a Neuropixelnek nevezett szondák kifejlesztése. Ezeken már áganként 1024 csatorna található, melyek közül a probe-ba épített logikai áramkörök segítségével választhatjuk ki melyekről szeretnénk jeleket felvenni. Ezekkel az elektródokkal még az is megoldható, hogy amikor az agyszövet elmozdul és az egyes sejtek jele szomszédos elektródákra vándorol, akkor megfelelő programozással megtartsuk a sejteket akár több napon keresztül is. Ezekben a fejlett szondákban már az elektródák közelében vannak elhelyezve a jel előerősítők, így sokkal zajmentesebb és ezért több sejt aktivitásának elkülönítésére alkalmas méréseket végezhetünk szabadon mozgó állatokban.
A legújabb technológia pedig a szövetbe juttatás után feloldódó hordozójú elektródákat használ, melyek jelét vezetőképes műanyagok továbbítják. Ezekkel a szabadon lebegő elektródákkal, melyek követik az agy mozgását, alakulását, azt a bravúrt hajtotta nemrégiben végre egy amerikai kutatócsoport, hogy egy kölyökegérbe ültetett elektróda hálóval a felnövekvő egérben követték egy éven keresztül az idegsejtek működésének alakulását.

A sokcsatornás elektródokat nemcsak sejtek azonosítására, hanem elektro-anatómiára is fel lehet használni. Ha egy szondán szabályos távolságra helyezünk el elektródákat akkor meg tudjuk mérni, hogy az egyes agyi rétegekben milyen EEG jel figyelhető meg. A csatornák közötti különbségek elemzésével pedig (CSD analízis) megérthetjük, hogy a különböző rétegekben elhelyezkedő sejtnyúlványokon milyen ionáramok folynak és ezek hogyan befolyásolják a jelfeldolgozást.

Az optogenetika megjelenésével új lehetőség és igény jelent meg a mikroelektródákat hordozó szondákkal szemben. A fény hatására sejtek serkentését vagy gátlását kiváltó opszinok tében és időben pontos bekapcsolására a szondákba a mikroelektródák és előerősítők mellé fénykibocsájtó lézerdiódákat is beépítenek a gyártás során. Így a szondák nem csak mérni, hanem befolyásolni is képesek a sejtek működését. Ez a kombináció új lehetőségeket adott annak meghatározására, hogy az egyes azonosított sejtek melyik agyterületre vetítenek. Az opto-tagging (fény-címkézés) eljárás lényege, hogy egy távoli agyterületre beadott vírus segítségével opszinokkal jelölődnek az oda vetítő sejtek. Ha ezek után fénnyel aktiváljuk őket, miközben mérünk, a megfigyelt jelalakok alapján meghatározhatjuk, hogy tüzelő sejtjeink közül melyek vetítenek a vizsgált célterületre és tüzelési mintázatuk miben tér el a többi megfigyelt sejtétől.

Ez idáig a technológiai lehetőségek felsorolása volt. De ezeket árnyalja a kétkezi valóság. A sejt és soksejt (unit és multi-unit) elvezetések nagy nehézsége, hogy az elektródák csak körülbelül 50 mikrométer távolságig hallják a sejteket, azaz nagyon pontosan kell őket beállítani. Az agy egy puding állagú szerv, mely egy kemény csontos tokba a koponyába van bezárva. Elektródáinkat valamihez rögzíteni kell, hogy ne mozduljanak el a sejtekhez képest. Erre két módszert használnak. Vagy az állat fejét rögzítik egy kerethez, melyhez az elektróda kapcsolódik, vagy fogászati cement segítségéve egy kis „koronát” építenek a koponyacsontra (altatás alatt) és ehhez rögzítik az elektródákat. Az első esethez altatott állatot használnak és az elvezetés csak néhány óráig tarthat. A fejre épített elektróda tartót (drive) viselő állatból már napokig, jól sikerült, tiszta, pontos műtét esetén hetekig lehet ugyanazon sejtek aktivitását megfigyelni, miközben az állat szabadon mozog. De egy-egy ilyen műtéthez pontos kéz és nagy rutin szükséges. Egyrészt, ezek az 1-4000 dolláros szondák hajszálnál vékonyabb, rideg és törékeny szilikonból készülnek!! Képzeljétek el milyen stresszes lehet egy ilyen drága tojáshéjjal dolgozni. Másrészt a koponyát és az agyhártyákat nagyon finoman kell megnyitni, különben az agyszövetet ért károsodások miatt az később megduzzad, elmozdul és a nehezen megszerzett sejtek eltűnnek.
Egy 5-8 órás szerelés-operáció alatt az elektróda sorokat hordozó szondákat (probe) rá kell szerelni a mozgatásukra szolgáló szerkezetre (drive), majd ezt a koponyához kell fogászati cementtel rögzíteni. Ezután be kell kötni az elektromos csatlakozókat, majd a méréseket zavaró elektromágneses zajok leárnyékolására egy rézhálóból készített apró Faraday kalitkát kell az egész köré építeni. Mindennek persze kicsinek kell lenni, hiszen az apró egér a fején viseli. Aki ügyes az egy probe-ot 4-6 állat egymás utáni mérésére is fel tudott használni, de minden mérés után hasonló precíz és idegőrlő szereléssel kellett a szondát leszerelni az állat fejéről (előtte leszedni a Farady kalitkát, a drive-ot).

A 3D nyomtatók megjelenése sokat segített. Manapság moduláris rendszerben nyomtatják műanyagból, illetve még jobb megoldásként fémből a szondát (probe) ot tartó pozícionálót (drive), az ezt tartó koronát és az azt fedő Faraday kalitkát. Külön nyomtatott adapter segítségével helyezhető be és távolítható el az érzékeny szonda. Így elérhető az, hogy ne kelljen minden alkalommal fogászati cementtel összeépíteni az elemeket és ki-be szerelés közben elkerülhető a kisebb vagyont érő szondák összetörése.

A sokcsatornás elvezetések méréstechnikai részét ezzel le is zárjuk. A következő #agytechnikák bejegyzésben a felvett jelek elemzésének trükkjeiről lesz szó.

Szerző: Gulyás Attila

(A cikk megírásához nyújtott segítségéért köszönet illeti Varga Viktor kollegámat)

Elnézést, hogy sokat kellett várni erre a bejegyzésre. Afféle vihar előtti csend volt, mert az elkövetkezőkben néhány elvont matematikai struktúrával kell majd megbirkózni az adatelemzés kapcsán. Időbe tellett, mire emészthetővé rágtam a mondandómat.

Ahhoz, hogy a gyors akciós potenciálokat (1.5-3 msec) finom felbontással tudjunk felvenni, legalább 6kHz-el, azaz másodpercenként 6000-szer kell kiolvasnunk az elektródánk feszültségét.

Ahhoz, hogy a jelszintet finoman tudjuk mérni 12, de inkább 14 biten kell tárolni azt. Praktikus okokból legyen ez 16 bit azaz 2 Byte. Tehát egy másodperc alatt egy elektródáról 6000x2 byte, azaz 12 kB adatunk keletkezik. No de jó esetben nekünk mondjuk 128 vagy 1024 elektródánk van, azaz másodpercenként 12x1024, azaz 12MB adatunk keletkezik. Ez egy óra alatt 3600x12MByte, azaz kb. 50GB. És egy szabadon mozgó állatnál a mérés órákig vagy akár napokig tarthat, azaz adhat akár 2-3 TB adatot is. Ki győzi ezt tárterülettel?

És ez még csak a kisebb probléma, mert ahhoz, hogy ezeket az adatokat elemezni tudjuk ezt az adatmennyiséget be kell olvasni és (legalább részben) a számítógép memóriájában kell tárolni. Nyilván ahhoz, hogy az adatelemzés lehetséges legyen mindenféle ravasz dolgokat kell leprogramozni. Erről lesz most szó.

Az adatfeldolgozás két lépcsőből áll. Az első az, hogy a sok elvezetésben megtaláljuk melyik sejt mikor szólal meg. A második lépés az, hogy az azonosított sejtek milyen csoportokban szólalnak meg és ez hogyan függ össze az állat viselkedésével.

Az első lépést a kutatók spike sorting-nak, azaz tüske válogatásnak hívják (tüske a kutatói szlengben az akciós potenciálok gyors kiugró jele az EEGben). Hívják még clusteringnek is, azaz csoportosításnak is a folyamatot. Sok szempontból hasonlít Hamupipőke munkájához, azaz, hogy a lencsét ki kell szedni a hamuból. Az extra gonoszság, amit a mostoha természet adott, az az, hogy nem egyfajta lencsét kell kiszedni, hanem sokat, és még azokat is különválogatni. Inkább hasonlít arra amikor az ember nem zárja be rendesen a szerszámosládáját és úgy kapja fel. Az eredmény: az összes különböző méretű fa és fémcsavar, anya, szög, tipli összeborul és válogathat az ember fél órát.

A válogatás azzal kezdődik, hogy a rengeteg csatornán megkeresik azokat az időpillanatokat, amikor valamelyiken (vagy többön) egy gyors akciós potenciál látszik. Ezeket az időpontokat és a megjelenő jelalakokat megjegyzik, a jeleket nem tartalmazó szakaszokat eldobják. A továbbiakban már csak ezzel, a jelentősen kisebb és hasznosabb adathalmazzal foglalkoznak. Ez mondjuk annak felel meg, amikor Hamupipőke kiszitálja a hamut. Ez egy számításigényes lépés, de nem túl bonyolult. Nagyjából automatikusan zajlik.
Ezután kezdődnek a ravasz dolgok. Ugye az elektródáink elrendezése olyan volt, hogy lehetőleg egy sejtről több felvétel készüljön. A következő lépésben megkeresik azokat az időpillanatokat, amikor több elektródán (csatornán) is egyszerre látszik tüske. Amelyik tüske csak egy csatornán jelenik meg azt eldobják, mivel nehéz lenne kitalálni több hasonló ilyen jel csak egy sejttől jön, vagy több eltérő helyen levő sejt ad hasonló jelet (további adatcsökkenés). Az egy pillanatban több csatornán is megjelenő tüske alakokat összeolvasztják, ez lesz egy esemény.

Ugye itt még nem tudjuk ez most egy vagy több sejt-e, de elkészítünk egy „képet”. Kicsit olyan, mintha több fotósunk lenne mondjuk egy hokimeccsen és minden gólról az összes fényképet egy fotóalbum külön oldalára tennénk. Aztán az eltérő szögből készült fotók nézegetésével próbálnánk meg kitalálni ki, honnan lőtte a gólt és ki, honnan adta a gólpasszt. Ugyanígy a tüskékről készült albumban sem tudjuk még melyik sejttől származnak a jelek. Sajnos itt nem 4-5 gólról van szó, hanem események tízezreiről, azaz kézzel válogatni esélytelen. Szerencsére léteznek olyan, viszonylag egyszerű, de sok számítást igénylő matematikai eljárások, amivel ezt a válogatást meg lehet csinálni. Ezek úgy működnek, hogy minden egyes tüskét, a jelalak tulajdonságainak függvényében elhelyeznek egy sokdimenziós térben (az egyes időpillanatban mért amplitúdókat felmérik egy-egy dimenzióra), majd megnézik, hogy a sok tüske által alkotott sokdimenziós pontfelhő felbontható-e elkülönülő részekre. Jelentkezzen az, aki háromnál több dimenzióban el tud képzelni ilyet 😊!

Márpedig a dimenziók száma nagy. Egy tüske, ami mondjuk 4 msecig tart, 6kHz-el vettek fel és 4 csatornán látszik, 6x4x4 adatponttal írható le, azaz 96 dimenzióban kell elhelyezni. Léteznek azonban dimenzió csökkentő matematikai eljárások, amelyek megkeresik melyek azok a dimenziók, amik mentén a tüskék elválnak, azokat megtartják, a többit eldobják (pontosabban beolvasztják). Akik tudják mi az a PCA, azoknak megsúgom, hogy azt használják. Ezek után már jelentősen kisebb dimenziókban kell elhelyezni a pontokat, szaknyelven kevesebb dimenzióba kell beágyazni az adatokat.

Ezután jön a felhőnézegetés. Próbájuk meg együtt 3 dimenzióban! Képzeljük el 3 elektródánk van, melyről egyetlen adatot, az adott pillanatban megjelenő tüske nagyságát (amplitudóját) olvasunk ki. Ezek után minden egyes tüskét egy ponttal fogunk jelölni egy 3 dimenziós térhálón. Az első csatornán mért amplitúdót az X, a másodikat az Y, a harmadikat a Z tengelyre mérjük fel. Így kapun egy 3D koordinátát, oda teszünk egy pöttyöt. Sok tüske pontfelhőt ad. Egy sejt jelei a 3 csatornán minden esetben ugyanakkora méret arányúnak várhatók, azaz a tér egyik részében lesznek, egy másik sejt jelei a tér egy másik részében. A számítógép ugyanezt meg tudja csinálni a 96 dimenzióból lecsökkentett, mondjuk 10-20 dimenzióban is.
A felhőt a számítógép a szerinte legjobban elkülönülő ponthalmazokra bontja. Egy-egy ponthalmaz feltételezése szerint egy-egy sejt tüskéiből áll.

De ezt sajnos még nem lehet elhinni, ugyanis biológiáról van szó, ahol egy sejt akciós potenciáljának alakja, a hálózat állapotának és az elektróda apró mozgásainak függvényében kicsit változik, aminek következtében a felhőbe kicsit elmosódva kerül bele. Az adatot tisztítani kell. Két hiba történhet. Egy sejt jeleit a számítógép két vagy több felhőrészbe helyezte (mert a jelalakjai időben változtak), ezeket össze kell olvasztani. Illetve az is lehet, hogy egy kupac pontot nem választott ketté és ezt nekünk kell kettévágni. Ebben az segít, hogy minden egyes tüskéről tudjuk mikor mértük. Ha felrajzoljuk az egyes feltételezett csoportokba tartozó sejtek tüzelésének egymáshoz képesti időpontját (kereszt-korrelációt, corss-correlation számolunk), illetve megnézzük egy csoporton belüli hogyan tüzelnek a sejtek (önkorreláció, autocorrelation) eldönthetjük, hogy vágni vagy összevonni kell csoportjainkat. Ehhez a válogatáshoz sok segítséget nyújt a számítógép, mivel könnyen emészthető módon ábrázolja a lehetőségeket, de még így is fáradtságos nagy koncentrációt igénylő feladat, amit sajnos az AI még nem váltott le.

Sokan Zen meditáció szerű relaxált állapotban csinálják ezt valamikor éjszaka amikor senki nem zavar. Volt, aki már arra is gondolt, hogy ír egy mobiltelefon app-ot és spike clusterező versenyt hirdet (citizen science).

Persze itt is látványos fejlődés figyelhető meg, mivel egy igen együttműködő közösség dolgozik a feladaton. Mindenki forráskóddal és ingyen elérhetővé teszi mások számára az elemző programjait. Ennek megfelelően hatalmas ugrások következnek be amikor egy újabb eljárás megjelenik. Egyik ilyen a template matching, azaz minta illesztés eljárásának kifejlesztése volt. Itt egy algoritmussal létrehoznak tüskealakokat és a mért tüskéket hasonlóság alapján próbálják meg hozzárendelni ezekhez. Ez a megoldás jól párhuzamosítható, azaz a modern videokártyákban jelenlevő több száz GPUra egyszerre lehet az adat részeit kiküldeni és begyűjteni a megoldást. A GPUkat tartalmazó grafikus kártyákat most már tehát nem csak FPS játékokra és bitcoin bányászatra lehet használni, hanem az agy működésének kikémlelésére. Ennek eredményeként a korábban 1 napig tartó előfeldolgozást mostanra 20 percre sikerült leszorítani. Persze utána jön még az elkerülhetetlen kézi simítgatás.

A megtisztított adatok elemzéséről legközelebb.

Szerző: Gulyás Attila

Köszönet Varga Viktornak a segítségért

Ha a sejtek szétválogatásával megvagyunk következik a második elemzési fázis. Igazából az egész dolog lényege. Megpróbáljuk sejtjeink tüzeléséből és tüzeléseik összefüggéséből kibogarászni mit és hogyan kódolnak.
Itt két megközelítés alapján dolgoznak a kutatók: az egyes sejtek működésének oldaláról (single neuron approach) és a sejtcsoportok működésének oldaláról (population approach).

A single neuron megközelítésben azt vizsgáljuk, a sejt hogyan (egyet, sokat, kisüléssorozatokban, szabálytalanul, szabályosan) és mikor (a feladat elején, végén, a tér valamelyik pontján) aktív, illetve más egyedi sejtekhez képest mikor tüzel (ha egy sejt tüzel később ő is tüzel vagy pont elhallgat). Ez a megközelítés viszonylag egyszerű számításokat igényel, igaz nagy számban.

Alapvető elemzésként fel lehet rajzolni mikor milyen frekvenciával tüzel a sejt. Itt a függőleges tengelyen a sejt tüzelését a vízszintes tengelyen pedig az időt, a kísérlet fázisát, az állat térbeli helyzetét vagy egyéb dolgokat szoktak ábrázolni. Azt is lehet, hogy a kísérleti terület 2D térképére egy pontot teszünk az állat helyzetéhez, amikor annak egy sejtje tüzelt. Ha az összes tüskét felrajzoltuk, láthatjuk, hogy például egy sejt a terep egyik sarkában szeret bekapcsolódni egy másik a másikban, azaz a sejteknek van „hely mezeje” (space field). Ezek a megközelítések tehát a sejtek szelektivitását (receptive field) képesek felderíteni.
Amikor azt vizsgálják egy idegsejt hogyan reagál egy ingerre, a legalapvetőbb dolog amit felrajzolnak az a PSTH: peri stimulus time histogram, magyarul az inger körüli eloszlás grafikon. Ez úgy készül, hogy feljegyzik a sokszor ismételt ingerhez képest (ez a 0 időpont) a sejt mikor aktív. Ebből látszik az, hogy sejtünk mozgatja-e füle botját az ingerre vagy nem. Ha nem reagál akkor a PSTH egy kb. egyenes vonal, hiszen az ingert megelőzően és azt követően ugyanolyan valószínűséggel tüzelhet a sejt. Ha reagál, akkor kisebb nagyobb púpot, vagy gödröt látunk a PSTH-ban a nulla pont után. A púp azt jelzi sejtünk fokozta működését, a gödör azt, hogy csökkentette, de ugye mindkettő egy reakció. A púp-gödör csúcsa pedig megmondja a kölcsönhatás kialakulásához szükséges időt.

Azt, hogy adott pillanatokban (vagy az egész kísérlet során) mi jellemző sejtünk tüzelésének szabályosságára azt az auto-correlation, azaz a saját tüzelésével, mutatott összefüggés kiszámolásával lehet vizsgálni. Kicsit hasonló a PSTH előállításához. Itt az történik, hogy megnézzük, hogy minden egyes tüske előtt és után mikor következik egy következő és egy táblázatba húzunk egy strigulát a megfelelő időponthoz. A végén a táblázatot felrajzoljuk. Ebből megtudhatjuk, hogy a sejtünk szabályosan (ismétlődően) vagy szabálytalanul tüzel-e. Változik-e a tüzelése a feladat fázisaiban.
A kereszt-összefüggést (cross-correlation) is hasonlóan számoljuk, itt azt nézzük meg hogy a sejtünk tüzelését az egyes lehetséges sejtek tüzelése mennyivel előzi meg vagy követi. Ezekből az ábrákból azt tudhatjuk meg van-e összefüggés két sejt tüzelése között. Ha a sejtünk tüzelése után egy másik sejt nagyobb gyakorisággal tüzel akkor valószínűleg egy serkentő kapcsolatot alkotnak. Ha sejtünk tüzelése hatására egy másik sejt elhallgat akkor sejtünk közvetlenül vagy közvetve gátolhatja a másikat.
Ha N darab sejtet sikerült elvezetnünk, akkor N*(N-1) keresztkorrelációt és N autokorrelációt számolhatunk (kiszámoljuk az összes sejtpár közötti korrelációt és a sejtek saját tüzelésével kapcsoaltos korrelációt). Ezt persze megtehetjük az egész elvezetésre, vagy csak kiválasztott időtartományokban. Ezen táblázatok alapján lehet egy feltételezett hálózatot rajzolni arról, hogy az N sejt hogyan hat kölcsön.

Egy ilyen táblázat alapján fel is lehet rajzolni az elvezetett sejtek egymásal alkotott kapcsolatainak feltételezett hálózatát.
Mivel ezek a módszerek viszonylag egyszerűek évtizedek óta használják őket és az igazat megvallva egyre kevesebb újat lehet belőlük megtudni az agy működéséről.

Ugye azt gondoljuk (leginkább Donald Hebb nyomán), hogy az agyban a kódolást és a feldolgozást a sejtek nagy csoportjainak (populációinak) aktivitásmintázata és annak változása hordozza. Mint ahogy egy digitális kamerában a fényképet a pixelek értékei hordozzák. Úgy az idegsejtek csoportjai is aktivitásuk mintázatában kódolják az agyban a külvilágból érkező és a belső információt. Azáltal, hogy egyrészt a technológiai fejlődés miatt lehetővé vált egy sejt helyett most már akár több ezer sejt aktivitását is mérni, másrészt az összetett adatfeldolgozáshoz egyre fejlettebb matematikai módszerek és az ezeket futtatni képes gyors számítógépek jelentek meg, az egyedi sejt megközelítést leváltja (végre valahára, sóhajtok fel) a populációs megközelítés.
 
Itt azt keressük, hogy nagyon sok sejt ki és bekapcsolódása mit jelenthet, milyen szabályszerűségek vannak benne, hogyan függ össze a sejtek működése a feladattal, magatartási állapottal.

És akkor itt megint jönnek a sokdimenziós felhők, amiket el kell képzelnünk. De miért kellenek a felhők? Azért, mert agyunk jó geometriában. Ezekkel a módszerekkel pedig geometrizálunk, térben helyezzük el az idegsejt tüzelés mintázatokat leíró problémát.
Ez egy ék egyszerű példával szemléltethető. Ha van 100 adatpontunk, akkor, ha a számegyenesen helyezzük el őket értékeik alapján jó nagy torlódás van, nem sok lehetőségünk van valami struktúra, összefüggés megragadására. Ha viszont nem 1D hanem 2D ábrázoljuk a pontokat, egyik tengelyre A tulajdonságuk, másikra B tulajdonságuk alapján elhelyezve akkor az egyenesre betömörödött pontok széthúzódnak és a szellős struktúrában már könnyebb formákat keresni. Ha több ezer pontunk van és mindegyiknek sok mért tulajdonsága akkor, ha sok dimenzióba „rajzoljuk” a pontokat akkor jobbak a lehetőségeink az elemzésre. És ugyan mi csak 3D látunk, a monitorunk meg csak 2D tud dolgokat mutatni, egy sokdimenziós térben a számítógép ki tudja választani azokat a dimenziókat, amik felől nézve látszanak legjobban, amiket keresünk és mondjuk ebből hármat vagy kettőt választva 3D vagy 2D meg tudja mutatni a szerkezetet. Hogy lehet egy 5D objektumot 3D (vagy 2D) megmutatni? Lásd a fenti ábra. A négyzetben felrajzolt pontokat, ha levetítjük az egyik tengelyre akkor eggyel kisebb dimenzióban is tudjuk a pontokat ábrázolni (igaz vesztünk felbontást). Azaz egy 20Ds objektumról készíthetünk kevesebb dimenziós vetületet, a hármat és kettőt már látjuk (https://youtu.be/YGmQe85cBeI). A sokdimenziós vizsgálódásokban az a szép, hogy 2 és 3D számolások - két pont távolsága, 3 pont szöge vagy egy pontfelhő átmérője, sűrűsége – egyszerű matematikával több dimenzióra is általánosíthatók (például pythagoraszi távolság).

Mondhatunk olyat például, hogy a sokdimenziós térben agyunk egyik állapota távolabb van a nyugalmitól, mint egy másik állapotban. Vagy a sejtek aktivitásfelhője kiterjed, beszűkül, megnyúlik, kettéválik.
Sok múlik persze, hogy több dimenzióba hogyan helyezzük el (ágyazzuk be, angolul embedding) az adataink pontjait. Az adattól és a kérdéstől is függ melyik a lejobb beágyazás.

Az egyik beágyazási mód az állapottér (state space). Itt annyi dimenziós teret veszünk ahány idegsejtünk van és egy adott pillanathoz tartozó pontot úgy helyezünk el, hogy minden idegsejthez tartozó tengelyre felmérjük annak a sejtnek a tüzelési erősségét. Ha az egymás utáni időpillanatokat összekötjük akkor kapunk egy sokdimenziós görbe vonalat, aminek mentén a rendszer mozog (trajektória, trajectory). Vizsgálni lehet, hogy ismételt feladatban vagy eltérő feladatokban ezek az útvonalak mennyire egyeznek vagy térnek el és ha eltérnek hogyan.

Az egyedi és populációs megközelítés közötti különbséget mutatja be a két ábra. A kísérletben egy megfelelő magasságú figyelmeztető hang elhangzása után az állatnak (egér) át kellett ugrania egy hirtelen felbukkanó akadáyt. A bal oldali ábrán azt látni, hogy a prefrontális kéregből (mely a döntésben és terveztésben fontos agyterület) közel 2000 idegsejt hogyan válaszol akkor, ha a kísérle során a figyelmeztetést jelentő hang (bal oszlop) vagy egy másik magasságú hang hangzott el (jobb oszlop). A hangok a szaggatott vonallal jelzett pillanatban szólalt meg. Az emészthetőség kedvéért a sejteket úgy rendezték, hogy felül vannak akik a legerősebb pozitív választ mutatták, alul pedig akik leginkább elcsendesedtek. Annyi látszik, hogy a hang adása után megváltozik a sejtek tüzelése. A megfelelő hang esetében a sejtek nagy része mutat erős pozitív vagy negatív választ. Ugyanazok a sejtek a nem megfelelő hangra (jobb oszlop) kicsit megnövelik válaszukat, de az egyes sejtek nem válaszolnak jelentősen eltérő módon.

Jóval többet lehet látni az alanti populációs elemzésen. Itt a sejtek több dimenziós térbe beágyazott viselkedésének ismételt kísérletek során megfigyelt trajektóriái látszanak, a legtöbb információt hordozó 3 dimenzió felől. A felső részen a kísérletet mutató idővonalon a pont mutatja, hogy a kísérlet mely pillanata látszik az ábrán. A bal oldal a hang megszólalása előtti pillanatot, a jobb oldal pedig az állat válaszának folyamatát mutatja.

A bal oldalon látszik, hogy a hangjelzés elhangzás előtt mindhárom esetben az idegsejt populáció ugyanott helyezkedik el (a felrajzolt trajektória a bekövetkező válaszreakciót mutatja). A jobb oldal a válasz alatti állapotot mutatja. A fekete pontok és a hozzájuk tartozó kis térrészt elfoglaló trajektóriák azokat az eseteket mutatják, amikor nem a figyelmeztető hangsz szólalt meg. A zöld pontok a zöld trajektórián a figyelmezttő hang elhangzása utáni sejtpopulációs válaszokat mutatják abban az esetben amikor az állat a helyes elkerülő válaszokat adta . A narancs pontok a figyelmeztető válasz utáni helytelen (nem elkerülő) válaszok alatti populációs aktivitásokat mutatják. Mivel a feket és a narancs eset elkülönül a zöldtől, de mindkettő kis térrészben mozog (ellentétben a zölddel) azt lehet megállapítani, hogy az állat agya, ugyan észlelte az eltérést a két hang között, de azért nem értelmezte a figyelmeztető hangot válaszra felhívó ingerként. A helyes válaszok (zöld) esetében a populáció ugyanonnan indult ahonnan a narancsárga, de utána el is mozdult. Ilyen típusú kísérletekből kibogarászható egyes agyterületeken miféle feldolgozás történik.

Mivel az idegsejtek működése gyakran összehangolt (korrelált) ezért az állapottérben megjelenő felhők, trajektóriák nem tetszőleges alakúak és csak rész dimenziókba terjednek ki. Ugye például ha X tengelyen egy marhacsorda állatainak korát, az Y-on pedig a súlyukat ábrázoljuk, akkor nem az egész grafikonunk lesz tele pontokkal, hanem a bal alsó saroktól a jobb felsőig fut egy hosszúkás pontfelhő (mivel az öregebb marha nehezebb, általában). A felhő hossza a fő dimenzió, az arra merőleges dimenzióban jóval kisebb a kiterjedés. Az állapottérben a pontfelhők/trajektóriák kiterjedését hívják sokaságnak (manifold) és ennek az alakját elemezve is lehet következtetéseket levonni az idegrendszer kódolási szabályairól. Úgy tűnik az idegsejt aktivitás dimenziója összefügg a feladatokat bonyolultságával, illetve eltérő lehet a mozgási és gondolkodási feladatok alatt. Gondolataink szabadabban Szárnyalhatnak, mint az izmok, ízületek és szalagok által meghatározott testünk, ennek megfelelően a gondolkodásban résztvevő sejtcsoportok magasabb dimenzióban helyezkednek el, mint a mosgáztervezésben résztvevő sejtek.

A sokaságok vizsgálatakor megfigyelhető, hogy vannak olyan dimenziók, amik mentén az aktivitás együtt mozog az inger vagy a feladat valamelyik tulajdonságával, ezeket hívják kódoló dimenzióknak (coding dimensions). Például a látókéregben az idegsejtek aktivitásának bizonyos arányú változása a színt, egy másik arányú változás pedig mondjuk a méretet kódolja. Mivel a dimenziók valamelyest függetlenek, ezért több dimenzióban mozogva a sejtpopuláció aktivitása több dolgot tud egyszerre kódolni.

Folyt köv...

Szerző: Gulyás Attila

Köszönet Varga Viktornak a segítségért

Egy fontos gondolat, hogy az idegsejt populációk aktivitásának időbeli változását leíró trajektóriákat számunkra nem mérhető erők alakítják. Ha azonban megfigyelünk sok trajektóriát, következtethetünk a hálózat viselkedését formáló erőkre, a hálózat dinamikájára (az aktvitás fejlődésére).

Az erők alapján kiszámítható minden egyes pontból merre szeret elmozdulni a rendszer.
A gondolat szemléltetéséhez egy hegyekkel, dombokkal, völgyekkel tarkított tájat kell elképzelni, amelyikre labdákat dobálunk. Ezek a domborzat lejtése alapján gurulnak végig a hegyek lábainál futó völgyekig. De eshet az eső is a hegyekben, melyből az összegyűlő víz patakok útján a folyóvölgyekbe gyűlik. Az állapottérben jelenlevő gyűjtő pontokat, vonalakat hívják attractor-oknak (attract=vonzani).

A trajektóriák alapján úgy lehet felrajzolni ezt a domborzatot és megtalálni az attraktorokat, hogy minden egyes pontban megnézzük merre mozdul el a rendszer, merre lejt a hegyoldal. Praktikusan a tér minden pontjába kicsi nyilakat rajzolunk, mely az elmozdulás (a ható erő) irányát és nagyságát mutatja (gradiens vektor). A nyilakat felhasználva, melyek az adott helyen a lejtő irányát mutatják, felrajzolhatók a hegyek völgyek.

A trajektóriák alapján meghatározott domborzat alapján pedig megérthetjük hogyan dolgozza fel az információt (hogyan dönt) hálózatunk. Mondhatjuk azt, hogy a hálózat tudása, információ feldolgozó képessége ebben a domborzatban és az általa meghatározott attraktorokban jelenik meg, melyek irányítják merre fejlődjön a rendszer állapota az információfeldolgozás során. Egy feladat kiértékelés, során az idegsejtek aktivitása a kiindulási pontból, belegurul valamelyik attraktorba. De ugye, mint a hegyvölgyes táj esetében is több pontból gurulhat ugyanoda a labda, a neuronhálózatok is indulhatnak máshonnan mégis ugyanoda jutnak. Ezzel ellentétes amikor közeli állapotból indulva távoli helyekre jutnak el. A földrajzban a vízválasztó fogalma azt jelenti, hogy vannak olyan csúcsok és hegygerincek, ahol két egymás közelében leeső esőcsepp jelentősen máshova jut el. Az Alpok bizonyos csúcsaira eső cseppek egy része a Dunán keresztül a Fekete tengerbe jut, más részük a Pó-n keresztül az Adriába.
Az agy információ feldolgozásának két fajtáját (kategorizálás-csoportalkotás és döntés) jól szemléltethetjük ezzel a domborzati képpel. Amikor egy dologról el akarja dönteni agyunk hálózata hova tartozik (kategorizálás) az olyan, mintha ledobná a labdát a domborzat egy pontjára és megnézné melyik völgybe gurul le.

Az Alpok egyik hegyvonulatának szintvonalas térképe látszik felül, vízválasztókkal és  folyóvölgyekkel. Alant ugyanezen terület 3D nézetének 2D képernyőfotója látszik a Google Earthből programban. Hogy eldöntsük egy ehető növény gyümölcs vagy zöldség-e képzeljük el, hogy erre a domborzatra a gerinc közelébe labdákat dobálunk. A gyümölcsöket (narancs, mandarin, alma, szilva) a sokdimenziós térben reprezentáló megfelelő sárga-narancsárga pontok  és a zöldségeket (karalábé, zeller, sárgarépa) reprezentáló lila-zöld pontok a piros vonallal jelölt zöldség-gyümölcs vízválasztó eltérő oldalain találhatók. A gyümülcsök északra, azaz a gyümölcsök völgyébe gurulnak le (sárga, nyilakkal díszített vonalak), a zöldségek délre a zöldségek völgyébe (zöld nyilakkal díszített vonalak). Ugye a paradicsomról még folyik a vita, hogy zöldség-e vagy gyümölcs. Legtöbben a zöldségek közé sorolják, pedig magas cukortartalma miatt helyesen gyümölcsnek kellene tartanunk. Nem véletlen, hogy a paradicsomból főzött édes lekvár, a ketchup, a gyerekek kedvence. A paradicsom agyunk hálózatában a vízválasztó közelébe esik, ezért bizonytalan melyik völgybe fog lefolyni (piros vonalak északra és délre).

A másik agyi feladat -a döntés- nem egy lefele guruláshoz, hanem egy felfele mászáshoz hasonlít. Az ábra jobb oldalán a kék (felfele kapaszkodó) útvonalak jelképezik, hogy a hegy lábától elindulva és egy völgyön felfele kapaszkodva a völgyelágazásoknál dönthet agyunk, hogy merre halad és így majd melyik csúcsra fog feljutni. A legmagasabbra, ami a vörösborban sus-vide-ált kacsa gyömbéres körtével, vagy egy kisebb csúcsra jutunk, mondjuk a tökfőzeléknél fasírozottal. Az egyes elágazásoknál pontos helyzetünk, azaz agyunk állapota és a környezet ingereinek kölcsönhatása fogja meghatározni merre megyünk. Ha megjelent egy cikkünk és a minap volt a fizetés akkor a tökfőzeléknek esélye sincs.

Mutatok két gyakorlati példát, hogy lássuk mire is jó mindez.
Az idegsejt és agyterület mintázatok elemzésének lehetőségeiről már 10 éve megjelent egy figyelemre méltó hír. Egy kísérleti alanyt fMRI-be fektetve nézték, hogy videók lejátszása során milyen mintázatban aktiválódnak a látókéreg területei. Egy tanuló hálózatot megtanítottak arra, hogy a videóképet asszociálja a megfigyelt agyi mintázatokkal. Ezek után a kísérleti alanyt hagyták elaludni a masinában és felvételeket készítettek agyműködéséről, majd megkérdezték a tanuló hálózatot, hogy szerinte az alany mit látott álmában. Az alanyt az ébredés után kikérdezték álmairól és megállapították, hogy 60%os jósággal sikerült megbecsülni milyen típusú álma volt a kísérleti alanynak.

Ennél hasznosabb hozománya is lehet sok idegsejt aktivitását megfigyelni. Amputált végtagú, vagy megbénult emberekben a mozgatókéreg idegsejtek aktivitását megfigyelve és elemezve bonyolult robot karokat lehet mozgatni vagy bénult esetében a kar izmait elektromosan stimulálni. Az idegsejt csoportok működésének elemzésével az egyes feltárt dimenziók hozzárendelhetők a művégtag mozgásirányaihoz vagy az izmok ingerléséhez. Így egészen bonyolult mozgásokat lehet „gondolati” úton vezérelni. Persze ez nem úgy megy, hogy bedugnak egy elektródát, rákötik a protézisre és a beteg máris hegedül, hanem több hónapos tanulást igényel mind a páciens, mind a vezérlést végző tanuló hálózat részéről. Hasonló ahhoz ahogy egy csecsemő megtanuljon fogni, járni másfél év kell.

Még egy fontos dolgot kell említenünk. Amikor ilyen nagy adathalmazokkal dolgozunk (nem csak idegsejt tüzelések, hanem egyéb big-data adathalmazok esetében is) nagyon oda kell figyelni, hogy miután kaptunk valami eredményt megvizsgáljuk az mennyire megbízható. Ha ugyanis sok adatunk van, akkor abban nagyon könnyű véletlen összefüggéseknek és struktúráknak látszó elemeket találni. Ezek nem biztos, hogy jelentenek valamit. Lásd felhőnézegetés. A gomolygó felhőben, mivel agyunk (és módszereink) mintázatkereső(k), sok érdekes állatot fogunk látni. De ugyanez a jelenség a babonák meg a városi legendák esetében is. Egyszer mondjuk az egyik utcasarkon találtunk 1000 forintot, mert reggel kicsit korábban indultunk el. Hajlamosak leszünk kicsit korábban elindulni, hiszen agyunk a megtalált pénz jutalma hatására megpróbált mindenféle korábbi eseményt megvizsgálni, mint okot. Talált egyet, bedrótozta, pedig csak kevés mérése (1 darab) volt. Sajnos ugyanebből a jelenségből élnek meg a rákot, az elhízást és még sok mást gyógyító sarlatánok. Amikor egyik családtagom rákbeteg volt a rokonságból mindenki ajánlott mindenféle csodaszert, mert hogy hallotta, hogy a Józsi bácsi is ettől gyógyult meg. Hiába magyaráztam, hogy én azt is szeretném tudni, hogy hányan NEM gyógyultak meg mielőtt a csodaszerekre sok pénzt pocsékolok.

Az ilyen hibák elkerülésére a kutatók szigorú eljárásokkal vizsgálják meg eredményeiket. Hirtelen most két módszert említek. Az egyikben kettévágják az adathalmazt és egyik felén végzik el az elemzést. Ha találtak valamit akkor azt a másik felén vagy az egybeolvasztott adathalmazon is megkeresik. Ha ott van akkor is, megnyugodhatnak, ha nincs ott elvetik. A másik eljárás, hogy az adatokat valamilyen módon összekeverik, lefuttatják az elemzést, megint összekeverik, megint elemeznek. Ezt akár több ezerszer megcsinálják és megnézik, hogy a véletlenül előállított adathalmazokban milyen erős összefüggéseket találnak, előfordul-e az a struktúra, amit találtunk. Ez lesz az alapvonal és a valós adathalmazon csak azokat az összefüggéseket fogadják el, amik jelentősen erősebbek (kisebb eséllyel fordulnak elő), mint a véletlen keverés útján kapott adatokból nyert eredmények.

Ezzel nem zártuk le a témát, az #agyséta rovat későbbi részben, ahol a hálózatok működéséről beszélünk további adalékokat osztunk majd meg az idegsejtek populációs aktivitásáról a későbbiekban.

Addig is, akit érdekel (vagy van olyan ismerőse, akit érdekel) a big data, az adatelemzés és a programozás, keressen magának egy agykutató labort és jelentkezzen! Az agykutatóknak mindig szüksége van fizikusokra, matematikusokra, programozókra, hogy egyre bonyolultabb elemzéseikhez új megközelítéseket fejlesszenek.

Szerző: Gulyás Attila

Köszönet Varga Viktornak a segítségért

Ugyan az # agyséta a szerveződési szinteken felfelé halad, mi itt most az #agytechnikák rovatban kicsit lefelé a sejtektől a sejtalkotórészek felé haladunk. Eddig a fénymikroszkópokról volt szó, most egy szinttel lejjebb lépünk. Bemutatjuk az elektronmikroszkópok fajtáit és hogy melyik mit mutat meg nekünk.

Először is mitől elektron egy elektronmikroszkóp? Miért nem jó nekünk a fénymikroszkóp? Azért, mert a fizika törvényei szerint az elérhető nagyítás (pontosabban a felbontás, azaz két pont közötti különbségtétel) összefügg a vizsgálathoz használt fény hullámhosszával.

Miért (miért, miért, miért kérdezi helyesen egy 2-3 éves gyerek, mert mindent tudni akar)? Képzeljük el, hogy találunk egy ősrégi épületben a kőpadlón egy nyílást. Csak annyit látunk, hogy sáros víz van benne. Kíváncsiak vagyunk mi lehet odabent, de mivel a víz sáros nem tudunk bevilágítani a vízbe. Fogunk egy karvastagságú botot és elkezdjük letapogatni mi lehet odabent. Kitapogatjuk, hogy hol vannak kiemelkedések és mélyedések. Sejtjük, hogy valami dombormű féle lehet, talán felirat is van. De vastag botunkkal nem tudjuk ilyen finoman letapogatni. Kerítünk egy ujjvastagságú pálcát, amivel a finomabb mélyedésekbe is be tudunk tapogatni, a dombormű részleteit kezdjük érteni, de a szöveg finom vésett rovásait még ezzel sem tudjuk letapogatni. Végül egy szöget erősítünk a pálca végére és ennek finom hegyével a vésett szöveget is ki tudjuk tapogatni. Nos a fénysugár is így tapogatja le a tárgyakat. Minél rövidebb a hullámhossza, annál finomabb részleteket képes letapogatni.

A fénnyel az a baj, hogy a látható fény legrövidebb összetevőjének a kék fénynek a hullámhossza 400 nm. Ezzel nagyjából két 200 nm-re levő pontot lehet elkülöníteni. De praktikusan a látható fényt használó mikroszkópok felbontása 1 µm körül mozog. A pontos felbontást megadó képlet (Rayleigh összefüggés) ennél bonyolultabb és az optikai rendszer tervezésének sajátosságait is figyelembe veszi, de ebbe most nem mennénk bele, nagyságrendi hibát nem vétünk.

Amikor a fizikusok megpróbálták kibogozni a kvantummechanika felépítése során, hogy a fény most hullám-e vagy részecske, Louis de Broglie rájött arra, hogy nem csak a fénynek, hanem minden anyagi részecskének is kettős: részecske és hullám tulajdonsága van. Ezt PhD tézisében írta meg 1924-ben, ami igen ütős munkának bizonyult, ugyanis 5 évvel később Nobel díjjal ismerték el munkáját!

Az elektron anyag, tehát de Broglie alapján az elektron is hullámként viselkedik, ha mozog. Az elektronsugár hullámhossza pedig függ az elektron energiájától, azaz mozgásának sebességétől. Minél nagyobb az, annál rövidebb az elektronsugár hullámhossza. Az orrát mindenbe beleütő zseni, Szilárd Leó (ugye a nukleáris láncreakció lehetőségére is Ő jött rá, szabadalmaztatta is, de később lemondott róla, hogy az ő általa Einsteinnek írt levél alapján elinduló Manhattan program atombombát tudjon készíteni) már 1928-ban próbálta meggyőzni Gábor Dénest, hogy készítsen elektronmikroszkópot. Úgy tűnik akkortájt a később a hologram felfedezéséért Nobel díjjal kitüntetett Gábor Dénes mással volt elfoglalva, mert az első működő elektronmikroszkópot Max Knoll és Ernst Ruska készítette 1931-ben (amiért 1986-ban osztottak Nobel díjat az akkor még élő Ernst Ruskának).

Az elektronmikroszkóp képalkotásának alapelve megegyezik a fénymikroszkópéval. Hasonló útvonalon haladnak az elektronok, mint a fény a megfelelően elhelyezett lencsék között. De a hasonlóság ezzel ki is merült, számos nehézséget kell megoldani ahhoz, hogy az elektronokat a megfelelő optikai pályán tudjuk tartani. Először is, mivel az elektronok negatív töltésű részecskék, ezért erős kölcsönhatásba lépnek az atomokkal, amikről szóródnak. Ennek orvoslására el kell távolítani az elektronok útjából az atomokat, praktikusan a levegő molekuláit, azaz vákuumot kell létrehozni, méghozzá egészen erőset, 10-7 Tor-t (a légköri nyomást, ami 760 Tor, 8 milliárdod részére kell csökkenteni) az elektronmikroszkóp belsejében, ami egy kb. 2 méter hosszú, fél méter átmérőjű, vastagfalú fémcső. Azért ilyen masszív, mert a külső nyomásnak ellent kell állnia és a keletkező Röntgen-sugarakat is vissza kell tartania.

Ha már van vákuumunk elő kell állítani a száguldozó elektronokat. Ehhez azt a jelenséget használják, hogyha erős árammal felizzítunk egy fémszálat akkor a magas hőmérsékleten gyorsan mozgó elektronok kilépnek a fémből. Ezeket az elektronokat ezután egy sugárba kell rendezni és felgyorsítani. Ehhez azt a trükköt használják, hogy a fémszálat nem csak izzítják, hanem egy előtte elhelyezett hengerhez, vagy lukas koronghoz képest erősen negatívan tartják. Így a felizzott szál elektromosan taszítani fogja a negatív elektronokat, amelyek boldogan repülnek a pozitív töltésű terület felé. Mivel ebben az elrendeződésben az izzószál negatív, klasszikusan katódnak hívják. Hogy az elektronokat mekkora feszültségen kell gyorsítani, az függ az elérni kívánt nagyítástól, hiszen a nagyobb nagyításhoz kisebb hullámhossz kell, ahhoz nagyobb feszültség. Az elektronokat az elektronmikroszkópok legegyszerűbb fajtájában, a transzmissziós elektron mikroszkópban (TEM), átvilágító EM-ben 60-12 000 V-al, azaz 60-120 kV-al gyorsítják. Ezután, a megformált elektronnyalábot a fénymikroszkópban lefutó fényhez hasonlóan lencsékkel kell alakítani, hogy a mintát pontosan tudjuk megvilágítani és utána nagyított képet kapjunk. Lencsének persze nem használhatunk üveget, hiszen az elnyeli, nem pedig eltéríti az elektronokat. Mint azt Oersted, Faraday és Maxwell óta tudjuk, a mágneses tér erőt fejt ki a mozgó elektromos töltésre, ezért alkalmas a repülő elektronok eltérítésére. Megfelelően (és nem is túl bonyolultan) formált mágneses terekkel az optikai lencsékhez hasonló módon lehet fókuszálni az elektronsugarakat. Ráadásul, mivel erre elektronmágneseket használnak, az elektron mikroszkóp nagyítása szabadon állítható viszonylag nagy tartományban. Egy neuroanatómus 1.000-80.000 szeres tartományban változtathatja a nagyítást, hogy miután a mintájában kis nagyításon megkereste a megfelelő idegsejtnyúlványokat, a szinapszisokat nagy nagyításban is meg tudja vizsgálni.

Ahhoz, hogy képet kapjunk szükség van még néhány ravaszságra. Amikor az elektronok valahova becsapódnak látható fényt nemigen bocsájtanak ki, viszont Röntgen- sugarakat bőven. Egy elektron mikroszkópban ezért az elektronokat egy cink-szulfiddal bevont ernyőnek ütköztetik, ami sárgászöld felvillanásokkal jelzi az elektronok becsapódását. Hasonlóan az oszcilloszkópok ernyőjéhez, ami ugyanígy felgyorsított és irányított elektronokat használ. Ezt az ernyőt egy ablakon keresztül egy nagyítóval lehet megfigyelni. Az ablak üvege vastag és ólmot tartalmaz. Egyrészt ellen kell állni a jelentős erőnek mely a légkör és a vákuum közötti légnyomáskülönbségből fakad, másrészt ki kell szűrnie a röntgensugarakat. Manapság a képet már a mikroszkópba épített CCD kamerák készítik és számítógépeken lehet elemezni őket. Mitöbb a minta mozgatása is pontosan motorizált. egfelelő program segítségével lépésenként hatalmas terület fényképezhető le, melyből automatikus montázs készül.

A felvezetés után a következő részben megvizsgáljuk mire is alkalmasak a különböző típusú elektronmikroszópok.

Szerző: Gulyás Attila

Az alapelvek után nézzük meg most, milyen klasszikus és modern típusai vannak az elektronmikroszkópoknak. A két klasszikus a TEM (transzmissziós, azaz átvilágító EM) és a SEM (szkenning, letapogató EM). Mindkettő megfelelően előkészített mintát igényel a képalkotáshoz. A TEM hasonlóan egy klasszikus fénymikroszkóphoz egy vékony metszetet „világít” meg elektronokkal.

A kép úgy alakul ki, hogy a minta különböző részei eltérő mértékben engedik át, illetve nyelik el vagy szórják az elektronokat. A vizsgálni kívánt szövetet az előkészítés során nehézfémsókkal, urán, ólom és ritkábban wolfrám sóival reagáltatják. A sók különböző mértékben kötődnek a fehérjékhez és elsősorban a sejthártyát alkotó zsírokhoz és eltérő erősségű árnyékot adnak majd. A feldolgozás hosszadalmas lépése, hogy a mintát műgyantával kell átitatni, majd hőkezeléssel kikeményíteni. Erre azért van szükség, mert a vizsgálandó metszetnek nagyon vékonynak, 40-70 nanométer vastagnak kell lennie, hogy ne nyelje el az össze elektront. Ilyen vékony metszetet, pedig csak egy kemény anyagból lehet vágni, speciálisan csiszolt, gyémántból készült pengékkel egy nagyon precíz szerkezeten, melyet ultra-mikrotómnak hívnak. A metszetkészítéshez kézügyesség, nyugalom és türelem kell. Tudományos munkám egyik legkedvesebb része ezen metszetek elkészítése volt, mert egy félreeső csendes, nyugodt helyen Zen nyugalomban lehetett csak ezt csinálni.

Az elkészült metszeteket a mikroszkópba helyezve jöhet a keresgélés. A TEM-et arra lehet használni, hogy a sejtek, sejtalkotórészek, nyúlványok és a közöttük található szinapszisok tulajdonságait vizsgáljuk. A minták előkészítésekor immunfestéssel EM vizsgálatra is megjelölhetők sejttípusok vagy azonosítható különböző típusú molekulák pontos elhelyezkedése, azáltal, hogy az anyagokhoz kötődő antitestekhez apró 5-15 nm-es, elektronokat elnyelő aranyszemcséket kötnek, vagy a fénymikroszkópban is használt DAB jelölésre elektronokat elnyelő fémsókat csapnak ki. 

TEM-el azonosíthatók a fénymikroszkópban két sejt között megfigyelt, feltételezhető kapcsolatok, és tulajdonságaik. Illetve, hogy egy szinapszisban pontosan hol helyezkednek el az eltérő típusú transzmitterek receptorai és egyéb moduláló molekulák.

Ennek legérdekesebb módszere a freeze-fracture replica labelling. Ezt akkor most fordítsuk le. A freeze-fracture azt jelenti, hogy fagyasztva törés. A mintánkat folyékony héliumban keményre fagyasztjuk, majd egy megfelelő szerkezetben kettétörjük. Amikor egy anyag törik, a törésvonalak mindig a leggyengébb helyek felé futnak. Egy biológiai mintában leggyakrabban a kétrétegű sejthártya két rétege mentén válnak el a felszínek, mivel itt a leggyengébb az összetartó erő. A sejtplazma vizes oldata és a fehérjék erősebben kötöttek (hidrogén hidakkal és kovalens kötésekkel) mint az apoláris zsírmolekulák (a között ható van der Wals kötések gyengék). Egy fagyasztva tört minta felszíne tehát axonterminálisok, dendritek, mitokondriumok felszínén fut, úgy néz ki mint egy dombormű, és alkalmas arra, hogy megvizsgáljuk ezeken a sejtalkotórészeken milyen molekulák és hol helyezkednek el.

No de hogyan látjuk ki hol van? Itt jön a replica labelling rész. Azaz másolat jelölés. A szétválasztott, két egymással szembe néző felszínre szén és platina atomokat gőzölnek, hogy legyen egy hordozó réteg, mely a fagyasztott minta felolvasztása után is merev marad. Ezekről a felszínekről azután leemésztik a biológiai anyag nagy részét. A dolog kicsit ahhoz hasonlít, mint amikor egy lábnyomot kiöntünk gipsszel, hogy megőrizzük. A kiemelt és letisztított gipszfelszín megőrzi a lábnyomot és apró kavicsok, fűszálak tapadnak bele. Itt csak a szénbe-platinába ragadt fehérje molekulák maradnak, melyeket aztán antitestekkel azonosítani lehet.  A különböző típusú antitestekhez különböző méretű aranyszemcséket kötnek és így a replikáról készített EM képen majd az eltérő méretű aranyszemcsék felhalmozódása jelzi, hogy a felszínre bukkant axonvégtalpak vagy dendritdarabok mely részén milyen fehérjék és milyen viszonyban helyezkednek el. Térképet rajzolhatunk arról, hogy az ingerületátvitelben fontos receptorok és moduláló molekulák, illetve az elektromos jelek továbbításában, hangolásában fontos ioncsatornák az idegsejtek mely részein, milyen mennyiségben találhatók.

Mivel a szövetből csak nagyon vékony (40-70 nm) elektronmikroszkópos metszeteket készítünk, a 3D struktúráknak csak 2D síkmetszeteit látjuk. Amennyiben 3Dben szeretnénk megérteni a vizsgált dolgok felépítését lehetőség van arra, hogy egymás után vágott több tucat vagy több száz metszeten ugyanazon területet lefényképezve 3Dben rekonstruáljuk a viszonyokat. A feladat szemléltetéséhez képzeljük el, hogy beteszünk egy tál makarónit a hűtőbe, amiben néhány húsgolyó van belekeverve. Amikor másnap kivesszük, az egész összedermed egy merev gombolyaggá. Ha ebből vágunk egy szeletet akkor látjuk síkban (2D) hogyan helyezkednek el a tekergő tészták és a húsgombócok. Ha vágunk egy másik szeletet újabb 2D síkot látunk. Ha kellően sűrűn és sok szeletet vágunk akkor kibogarászhatjuk hogyan futnak a makaróniszálak és hogyan veszik körül a húsgolyókat.

A 3D megjelenítés alkalmas arra, hogy számszerűsítsük egy-egy nyúlványon hány szinapszis található vagy egy axonvégződésben mennyi szinaptikus hólyagocska és átvivőanyag receptor található és hol. A későbbiekben bemutatott modern EM-ek ennek a folyamatnak a gyorsítására ravasz technikai trükköket használnak.

A SEM-et, a pásztázó (szkennelő) EM-et az agykutatásban ritkán használják. Ezekkel a mikroszkópokkal inkább kisebb nagyításban (200-2.000X) vizsgálnak rovarokat, egyedülálló sejteket, vírusokat. A mintákat itt is elő kell készíteni. A minták felszínére néhány atom vastag szén vagy arany réteget gőzölnek.  A mintákat a SEM-ben nem átvilágítják, hanem egy vékonyra fókuszált elektronsugárral letapogatják. Az egyes pontokról visszaverődött elektronok mennyiségét mérik és így alkotnak képet, mely nagyon jól mutatja a minták felszínének apró részleteit 3D-ben. A SEM-ekről nem is ejtünk több szót, csak a TEM-ek továbbfejlesztett változatait és SEM-ekkel alkotott hibridjeit fogjuk megismerni, mert ők fontosak az agy működésének kutatásában.

Az egyik egyszerű továbblépés, amikor az elektronok gyorsítófeszültsége nagyobb, mint a normál TEM-ben. A nagyenergiájú elektronokkal egyrészt finomabb felbontással vizsgálható a szerkezet, még nagyobb fehérjemolekulák alakja és kapcsolódásuk módja is kivehető. De így vastagabb (több elektront elnyelő) minták szerkezetét is vizsgálhatjuk.

A TEM tomográfia (elektron tomográfia) hasonlóan működik a röntgen tomográfiához, amit CT néven ismernek a laikusok. A tomográfia lényege, hogy különböző irányokból számtalan szögből lefényképezzük, hogy a mintán hogyan jutnak át az elektronok (ezek mindegyike egy 2D TEM fénykép). Ezek után az egyes képek szögelfordulását ismerve egy számítógépes algoritmussal visszafejthető hogyan is helyezkedtek el 3Dben az elektronokat eltérő mértékben elnyelő struktúrák. Ezzel sejtalkotórészek, sejten belüli kapcsoldási viszonyok és molekulahalmazok 3D szerkezetét lehet feltárni.

A TEM-nek és a SEM-nek létezik egy hibridje (Scanning TEM). Itt pontonként világítanak meg egy TEM mintát és az átjutó elektronok mennyiségét mérik. A kép itt élesebb és kontrasztosabb, mint egy sima TEM-ben. Hasonló a különbség, mint egy klasszikus filmre készült kép és egy soroknént kiolvasott CCD chipből kapott kép között.

A 2D metszetsorozatokból készíthető 3D rekonstrukciók iránti igény több sorozatrekonstrukcióra alkalmas EM-et is eredményezett. Az Array SEM-hez szilikon lapokra metszik gyémánt késsel a metszeteket és ezen szkenneli be egy elektronsugár a mintákat finom felbontással. A block face SEM, egy olyan szörnyeteg, amibe egy ultramikrotómot építenek be egy TEM-be. Miután a mikrotóm levágott egy vékony szeletet, a minta felszínét beszkennelik, majd újabb metszetet vágnak le és újra szkennelik. Ennek változata, ahol a metszet felszínéről nem késsel távolítanak el egy réteget, hanem fókuszált ionsugárral elpárologtatják. Két párologtatás között pedig szkennelnek.

Ezekkel a módszerekkel mostanra már irgalmatlan adatmennyiségeket állítanak elő, több száz mikron, közel milliméter élhosszúságú és vastagságú kockákban sikerült már akár teljes sejtek nyúlványrendszerét és a körülöttük található több millió más nyúlványt digitalizálni.

Tíz éve még fárasztó kézi munka volt a 3D rekonstrukció. Mostanra már komoly software támogatással történik a rekonstrukció, bár még így is kemény munka megtalálni, merre szaladnak és kihez tartoznak a nyúlványok. A legújabb fejlemény a mesterséges intelligencia (AI) bevetése az azonosításban. Ezek segítségével igazi big-data módon szabadon hozzáférhető adatbázisokban keresgélhetnek a kutatók, hogy a fáradtságos munkával előállított 2D adathalmazból minél több információt nyerhessenek ki. Ennek eredményeként már dolgoznak a kutatók azon, hogy egy féreg vagy egy muslinca teljes idegrendszerében feltérképezzék az egyes sejtek kapcsolatrendszerét.

Van még néhány más irányú fejlesztés is. A fenti elektronmikroszkópos módszerek hátránya az, hogy a klasszikus TEM vizsgálathoz az élő szövetet roncsoló beavatkozásokkal ki kell vonják a vizet a mintából, aminek hatására a fehérjék és a fehérjecsoportokból összeállt molekuláris „gépek” szerkezete megváltozik. Mivel az EM-ben vákuum van, eredeti állapotban levő, víztartalmú mintát nem lehet egy EM-be helyezni, mert a víz azonnal elforrna a vákuumban. A probléma megoldására fejlesztették a Cryo-TEM, azaz a fagyasztásos TEM technikát. Ha a vizsgálandó mintát villám gyorsan lehűtik, a molekulák eredeti állapotukba fagynak. Ha a metszés és a vizsgálat alatt is hűtik a mintát, azt a folyékony nitrogén -170 C fokos hőmérsékletén tartva a fehérjék szerkezetét megőrző jég nem szublimál el és a minták vizsgálhatók. Ehhez a TEM-et a finom felbontású módok: cryo elektron-tomográf, elektron diffrakció vagy single particle analysis (egy részecske vizsgálat) valamelyikében használják. Ezek a módszerek mára kiváltották a korábbi molekulaszerkezetet vizsgáló módszereket, mint a Röntgen krisztallográfia vagy az NMR (mag mágneses rezonancia).

Ezzel végére értünk a mikroszkópok világának. A molekuláris biológia fegyvertárát, majd az agyi képalkotó technikákat vizsgájuk meg az #agytechnikák rovat következő bejegyzéseiben.

Szerző: Gulyás Attila

Minap jelent meg egy hír a KOKI honlapján, hogy két fiatal kutatónk a HUN-REN ARP tudományos „nagykövete” lett. A hír kifejti mit is jelent ez és beszélget a kutatókkal.
Erre nagyon jól rímel, hogy az #agytechnikák rovatban a tudományos együttműködés egyik nagyon fontos új módjáról írjak: az adatok mindenki által elérhető, jól szervezett formában való megosztásáról.

Tycho Brahe a dán királytól kapott támogatásból 1571-ben egy kiemelkedő pontosságú csillagvizsgálót épített Uraniburg szigetén, mert szerette volna nagyon precízen meghatározni a csillagok helyzetét és a bolygók mozgását. Évtizedeken keresztül, naponta pontosan rögzítette a bolygók és csillagok helyzetét, de mint ahogy Smaug a sárkány ült a kincskupacon Tolkien Hobbit-jában, Brahe is úgy ült adatain. Mivel maga egy megfigyelő csillagász volt nem pedig elméleti, szerencsés volt a tudomány, hogy halála előtt egy évvel a cseh királyi udvarban megismerkedett Johannes Keplerrel, aki matematikában járatos, elméleti csillagász volt és a bolygók bonyolult égi táncának törvényeit akarta megfejteni (sok baj volt már addigra az epiciklusokat használó ptolemaioszi világképpel). A két szakértelem találkozásából születtek a Kepler törvények, amik nem sokkal később Newton törvényeihez és a modern fizika kialakulásához vezettek. De a tudománytörténet leírja azt is, hogy Keplernek milyen kemény munkájába került, hogy hozzáférjen az adatokhoz. És ez még jónéhány évszázadig így is maradt, aki megtermelte az adatokat féltve őrzött kincsnek tekintette.

Az elmúlt évtizedekben a szemléletváltozás és néhány kezdeményezés hatására ez a világkép átalakult. A folyamatban, hogy adatainkat mindenki számára elérhető formában elérhetővé tegyük a meteorológusok (már 1873-ban egy bécsi konferencián megegyeztek az adatmegosztás formájáról), a csillagászok és a fizikusok (CERN, LIGO) jártak az élen (ugye ennek köszönhetjük az internetet is!). A nemzetközi emberi genom projekt és egyéb genom projektek (Drosophil, Coenorhabditis) kapcsán aztán részben a biológusok is csatlakoztak. A genetikusokat az agykutatók követték, akik 3Dben rekonstruált idegsejtjeiket és az agyban ketyegő idegsejtek tüzelési mintázatát osztották meg.

A megosztás mögött persze nem csak az egyetemes altruizmus áll, hanem számos praktikus nyomás. Egyrészt a mai tudomány annyira bonyolult, és annyi speciális tudást igényel, hogy egyszerre senki sem tud pontos műszereket tervezni, építeni, azokon mérni és a méréseket feldolgozni. Ezért a hatalmas optikai és rádió távcsöveket építő, majd azokból adatokat nyerő csillagászoknak elemi érdeke volt, hogy azokat az adatokat az elméleti szakemberek is megvizsgálják (lásd Brahe és Kepler esetét). De az internet világában egyszerűbb megosztani az adatokat, hogy azt megtalálják és felhasználják az elméleti szakemberek, mint a cseh király udvarában találni valakit. Nincs is már cseh király.

Természetesen a cikkben társzerzőként mindkét fél megjelenik vagy mostanában az is modell, hogy írnak egy cikket a megfigyelők és ezekre a cikkekre hivatkoznak az elmélészek. Mindenki jól jár. A dolog azért igazán hatékony, mert nem kell a mérő szakembernek egy bizonyos ötletéhez megkeresni az elméleti szakembert, hanem elméleti szakemberek hordái keresgélnek az adatbázisokban, hogy mi érdekeset lehet találni. Vagy ha van egy elméletük bizonyítékot találhatnak rá az adatok elemzésével. A csillagászoknál a gyors égi folyamatok miatt a megosztás olyan fokú, hogyha valaki észlel valami figyelemre méltót, akkor automatikus rendszerek küldik hírét az eseménynek, hogy mindenki a megfelelő helyre fordítsa optikai vagy rádió távcsövét, esetleg röntgen, gamma vagy infravörös űrtávcsövét.

A másik tényező, hogy manapság a tudományt nem a nemesemberek vagy a király pénzeli, hanem nemzeti és nemzetközi szervezetek, az adófizetők pénzéből. Azaz a létrejött adatok köztulajdonban vannak, ezért elérhetővé kell tenni őket mindenki számára. Természetesen itt vannak türelmi idők, a mérést végző kutatók meghatározott idejű moratóriumot hirdethetnek adataikra, hogy munkájuk gyümölcse beérhessen számukra. De miután első közleményeik megjelentek a közösség is keresgélhet bennük összefüggéseket.

És itt jön a harmadik dolog. Az adatokhoz nem csak kutatók, hanem érdeklődő magánemberek is hozzáférhetnek. Hozzá is férnek és sok témában sokukat már nem lehet laikusnak nevezni. A kutatók tudják azt, hogy „Több szem többet lát!” és aktív kezdeményezések formájában vonják be a civileket a kutatásba. Vannak, akik az adatgyűjtésbe (állatok, növények számolása, szupernovák felbukkanása), vannak, akik az adatok elemzésébe vonják be a lelkes civileket. Akár számítógépes játék formájában, mint a fehérjeszerkezet hajtogató Foldit. Akit érdekelnek a lehetőségek annak csak egy egyszerű keresést kell csinálnia és már jönnek az Európai, USA, NASA által felajánlott projektek.

A dolog persze komoly felkészülést és szervezettséget igényel az adatokat előállítók részéről. Az adatokat annotálni, címkézni kell. Pontosan vezetni hogyan mértük, mi van benne, mihez kapcsolódik stb. Egy kutatónak ehhez sok dolgot kell megtanulnia, leszoknia a cetlikre jegyzetelésről, érteni az adatbázisok lelkivilágát. Meg kell tervezni azt is, hogyan a leghatékonyabb tárolni az adatokat. Ezekben ma már segítséget kapnak adatbázisokhoz értő szakemberektől. Ennek az új kutatási kultúrának fontos szereplői a cikkben említett „nagykövetek”, akik az új adatszervezési és megosztási szemlélet fontosságát terjesztik.

Keressen mindenki magának egy citizen science projektet és csapjon bele a kutatásba!

Szerző: Gulyás Attila

Az agy szerkezetvizsgálatának egy fontos lépése kimaradt az #agytechnikák rovatból. Ráadásul az első. Írtunk a festésekről a mikroszkopizálásról, de arról nem hogyan jutunk hozzá a biológiai mintákhoz.

Ennek módja pedig nagyon nem lényegtelen!
Egy biológiai rendszer, egy élőlény, annak szövetei, és azok sejtjei, hihetetlen mennyiségű kölcsönható molekulából állnak. Egy sejtet úgy kell elképzelni, mint egy több millió bonyolult, bár apró gépből álló gyárat, mely gépek több milliárd alkatrészének térben és időben nagyon pontosan kell összekapcsolódnia ahhoz, hogy a sejt, az élet működjön.

Ha vizsgálni akarjuk mi történik egy sejtben, esetünkben idegsejtben, akkor ezt az élő rendszert minél pontosabban kell a vizsgálatra alkalmas állapotban megtartani. Nyilván a legegyszerűbb, ha életben tartjuk. De ez nem mindig lehetséges, mert pl. egy patkány nemigen fér be egy elektronmikroszkópba. Azaz kisebb darabokat kell olyan állapotba hozni, hogy szerkezetük megmaradjon az élőhöz minél hasonlóbb állapotban.

A gond ott van, hogy amikor egy szövetdarabot eltávolítunk megszűnik annak vérkeringése, lehűl és egyéb dolgok történnek vele. Amikor megszűnik egy sejt oxigén- és tápanyag-ellátása, azt az energia termelését végző mitokondriumok a másodperc tört része alatt megérzik. Sejthártyájukon nem áramlanak többé a protonok és megáll az ATP termelés. Egy sejt számára ez az egyik alapvető jel a programozott sejthalál, az apoptózis beindítására. Ez egy aktív öngyilkosság, egy folyamat, mely az eukarióták (valódi sejtmagvasok, mint mi is) 2 milliárd évesegy evolúciója során alakult ki és a szervezet jól összehangolt működésének biztosításához szükséges. Ez akkor hasznos, ha csak egyes sejtekkel van baj (vírusfertőzés, daganatsejt, hősokk, stb. esetén), de nyilván ha minden sejtet érint akkor nem előnyös, de hát ilyenkor már úgyis mindegy az élőlény szempontjából. De nem a kutató szempontjából.
Ugyanis a sejthalál során rengeteg fehérjebontó enzim szabadul fel, pillanatok alatt, hogy a sejt molekuláris gépeit lebontsa. Normál esetben ez arra való, hogy a sejt ilyenkor felszabaduló alapanyagait más, egészséges sejtek felhasználhassák. Azaz, ha minimális mértékben is teketóriázunk, működő sejt helyett egy romhalmazt tudunk csak vizsgálni. A biológus problémája tehát az, hogy hogyan lehet egy élő sejtből mihamarabb egy NAGYON halott (nem haldokló), egyáltalán nem működő, rögzített szerkezetű sejtet kapni.

A megoldásra számos próbálkozás született. Amit a (neuro)anatómusok legrégebb óta használnak (nem szükségszerűen a legjobb megoldás) az a szövetek aldehidekkel való rögzítése, a fixálás. Ki nem látott még anatómia múzeumokban formaldehidben úszó végtagokat, embriókat, brrr.

Az aldehidek (formaldehid és paraformaldehid) a fehérjék lizin aminosavához vagy a fehérjék peptidkötéseiben levő -NH- csoport hidrogénjéhez kötnek, hidroxi-metil csoportot, majd ezek összekapcsolódás után metilén hidat képezve. Röviden, keresztkötésekkel rögzítik a fehérjéket, magukon belül és egymás közt. Olyan ez, mintha a finom molekuláris gépekbe finom molekuláris csavarkulcsokat dobálnánk vagy leöntenénk molekuláris betonnal. Minden befagy, lemerevedik, megállnak a folyamatok. A fixálás előtti agy egy rózsaszín pudingszerű, mállékony anyag, mely a fixálás után egy fehéres-szürkés gumiradír állagú, ha leesik felpattan anyaggá változik. Ez két szempontból jó. Egyrészt fixált, azaz lehet az eredeti állapotot vizsgálni, másrészt keményebb ellenállóbb lesz, lehet belőle például a festésekhez és mikroszkópos vizsgálatokhoz szükséges vékony (40-90 µm-es) metszeteket vágni az erre a célra szolgáló mikrotóm nevű szerkezeten.

Ezzel a megközelítéssel az a baj, hogy ha egy szövetdarabot beledobok aldehidbe akkor az csak diffúzióval jut be a szövetbe, és később ér oda, mint hogy az oxigén elfogy és beindul a sejtpusztító apoptózis. Megoldásnak azt találták ki az anatómusok, hogy elaltatják kísérleti állatukat, majd a szíven keresztül a vérkeringésbe juttatják az aldehideket, melyek a legfinomabb hajszálereken (kapillárisokon) keresztül eljutnak a szervezet minden sejtjéhez. Ezzel a módszerrel 2-3 percre lehet lerövidíteni az átmeneti időt.

Ez jobb, mint a semmi, de sokszor nem elég gyors. Valami olyan módszert kell kitalálni, ami egyszerre egész térfogatában állítja meg a folyamatokat. Erre két irány van, vagy nagyon gyorsan hűteni, vagy nagyon gyorsan melegíteni kell a mintát. A gyors hűtés jégbe fagyasztja a rendszert, azaz minden a helyén marad, leállnak a kémiai folyamatok. A gyors melegítés pedig denaturálja a fehérjéket, működésképtelen alakba (konformációba) csapja ki őket. Értelemszerűen ez nem feltétlenül jó mindig, pl. amikor antitestekkel akarunk immunfestést végezni, hiszen azok a fehérjét szerkezete alapján azonosítják, és ha ez megváltozott akkor nem járunk sikerrel.

Persze a hűtés / melegítés esetében is fennál az a gond, mint ami az aldehidek esetében. Ahogy az aldehidek lassan diffundálnak a hőterjedés is véges sebességű. A melegítés esetében kisebb a gond, mert mikrohullámot használva az anyag belseje is melegíthető. Azaz egy anatómus laborban találhatók erre a célra használt mikrohullámú sütők, amikbe az aldehidben úszó mintákat melegítik a gyorsabb és alaposabb fixálás eléréséhez.

A gyors hűtéshez is kidolgoztak ravasz rendszereket. Az ingerületátvívő anyagok felszabadulásának lépéseit vizsgáló agykutatók hekkeltek egy speciális szerkentyűt, mely az agyból hihetetlen gyorsan kicsippent egy darabot, majd folyékony héliumba mártott rézlapok közé zárja. A folyékony hélium fura kvantum tulajdonságai miatt a legjobb hővezető anyag, ezért nagyon hatékonyan hűt. De persze még így is csak fél milliméter méretű anyagdarabokat tudnak kellően gyorsan áthűteni. Ezzel a módszerrel sikerült elektron mikroszkópos felvételt készíteni arról a pillanatról amikor egy ingerületátvívő anyagot felszabadító hólyagocska (vezikula) éppen beleolvad az axonvégződés sejthártyájába és a szinaptikus résbe önti tartalmát. Volt olyan kísérlet is (én egy kicsit elkeseredett próbálkozásnak nevezném), ahol egy egeret hosszú ideig treníroztak arra, hogy egy tanulási feladat végén ugorjon be egy lukba. Amikor ez már jól ment a luk túloldalára egy folyékony nitrogénnel teli tartályt tette. Ebbe érkezett az egér…. a cél az volt, hogy elcsípjék mi történik az egér agyában tanulás közben. Arra már nem emlékszem ez mennyire volt sikeres megközelítés, de a tényből, hogy kevesen használjak ezt a módszert, úgy tűnik nem volt sikeres, vagy csak az állatetika bizottság nem ad ilyenre engedélyt.

A fixálást, vagy rögtön vagy az anatómiai festések elvégzése után, követi egy fontos lépés, melynek során a minta víztartalmát (vagy fagyaszott minta esetében jégtartalmát) több lépésben műgyantára cserélik (régen paraffinba ágyazták a metszeteket). Ennek célja, egyrészt, a minta gyakorlatilag örök életre való megőrzése, másrészt keményítése, hogy az elektron mikroszkópiához szükséges 30-70 nm (a fény hullámhosszával összemérhető) vagy a fénymikroszkópiához szökséges 20-40 mikrométer vastag metszeteket lehessen készíteni. A harmadik cél a minta átlátszóvá tétele, hogy fénymikroszkópban jól vizsgálható legyen.

Összefoglalva: A fixálás lényege, hogy az élő rendszert mielőbb hozzuk a vizsgálatra alkalmas, tartósan rögzített állapotba.

Szerző: Gulyás Attila

Alapos ember mielőtt nekilát valaminek tervez. A kutató nagyon alapos, ezért alaposan tervez. A MikroProject lépéseit először átgondoltuk, majd megírtuk hozzá a kísérleti tervet, mely egyben majd jegyzőkönyv is lesz. Vezet minket utunkon és később pedig vissza tudjuk keresni mit hogyan csináltunk, miben tértünk el vagy kellet eltérnünk a tervezettől. A jegyzőkönyvezés nem csak nekünk segít, hanem elvárás is, hiszen munkánk hitelességét később is bizonyítanunk kell.

Mik is a lépések:

• Állattörzsek kiválasztása
• Oldatok készítése.
• Egéragyak fixálása
• Metszetek készítése
• Metszetek mosása, festése
• Metszetek tárgylemezre rakás
• Metszetek mikroszkópos vizsgálata, scannelése
• Adatok elemzése

No persze itt mindegyik lépés több részlépésre tagolódik.

A kiválasztott két törzs egyike a BAC-PV EGFP kódot viselte. Ez azt jelenti, hogy olyan transzgén állat, amibe egy BAC, bacterial artificital chromosome (mesterséges bakteriális kromoszóma) van bejuttatva, mely a parvabumin nevezetű kalcium köt fehérje promoterét és utána kötött EGFP kódját (enhanced green fluorescent protein, felerősített zöld fluoreszcens fehérje) hordozza. Az ilyen állatokban minden sejtben mely parvalbumint termel megjelenik a zöld fuoreszcens fehérje. Mivel a parvalbumin az izomsejtekben is jelen van (elősegíti azok gyors összehúzódását) gyakorlatilag UV lámpa alatt az egész állatka világít). Mi azért használtuk ezt a törzset, mert az idegrendszerben a parvalbumin a legerősebb gátlást kifejtő gátlósejteket jeleníti meg. Arra voltunk kíváncsiak a tanszgén állatban valóban ezek a sejtek világítanak-e. Azaz lehet-e őket arra használni hogy világításuk alapján PV tartalmú gátlósejteket tudjunk elcsípni.

A másik törzs kódja BAC GlyT2 EGFP volt. A GlyT2, a glicin nevű aminosavat vezikulákba töltő transporter fehérje génjének a rövidítése. Azok a sejtek, melyek glicint használnak átvivőanyagként kifejezik ezt az anyagot és a transzgén állatban az EGFPt mely a sejt teljes nyúlványrendszerét kitölti. A glicin a GABAhoz hasonló hatású gátló ingerületátvivő anyag. Először e gerincvelőben írták le, hogy a glicinrészt vesz az idegi ingerületátvitelben, de később számos agyi pályában is megtalálták. Ha ellenőrzésünk sikerrel jár tudni fogjuk, hogy ebben az állatban a glicint használó idegsejtek és pályák jelülődnek.

Terveink szerint mindkét állattörzsből 2-2 állatból készítünk metszeteket (egy mérés ugye nem mérés, ennél nagyobb elemszámokkal szoktak a kutatók dolgozni, de egy felderítő diák projektnél a 2-2 elfogadható). Ezek egy részét nem festjük csak fluoreszcens mikroszkópban vizsgáljuk a jeleket. Egy-egy sorozaton azonban kettős immunfestést végzünk, egyrészt zöld fluoreszcenciával felerősítjük az EGFP jelet, másrészt a PV állatban PV ellen festve piros fluoreszcenciával megjelöljük a PV tartalmú sejteket, a GlyT2 állatban pedig egy másik kalcium kötő fehérje ellen a Calbindin ellen festünk pirossal. A PV esetében szeretnénk meggyőződni arról, hogy a transzgén kifejeződése helyes-e, azaz csak PV sejtekben van jelen, de azokban mindig. GlyT2 állat esetében azt vizsgáljuk, hogy a Calbindint kifejező gátlósejt csoport mennyire fed át a glicint transzmitterként használó gátlósejt csoporttal.

Hogyan tovább?

Az agyak fixálásához az elaltatott egerek vérkeringését először 4 C fokos fiziológiás sóoldattal, majd 4 C fokos 4% paraformaldehidet tartalmazó 0.1M (mólos) foszfát pufferrel kell átöblíteni. Mint korábban írtuk, a véráramon keresztül lehet az agyba megfelelőn gyorsan eljuttatni a fixálót.

A fentiekhez fiziológiás sóoldatra (röviden fizsó) és 0.2M pH=7.4 PB-re (angolul phosphate buffer, foszfát puffer) és a fent említett fixálóra van szükségünk. Ezeket a kísérlet kezdete előtti napon készítettük el, hogy legyen idejük lehűlni. Annak rendje és módja szerint volt mérőhenger, főzőpohár, köpeny, precíziós mérleg meg minden. Az oldatkészítésről és egyebekről készült jegyzőkönyv itt tekinthető meg.

De miért is kell a fizsó meg a puffer? Azért, mert élő, vagy nemrég élt rendszerrel dolgozunk. A szervezetünket és az egér szervezetét is alkotó fehérjék kényes molekulák, mint Borsószem királykisasszony. Eredeti szerkezetüket és működésüket csak akkor őrzik meg ha megfelelő a környezet ionkoncentrációja, kémhatása (pH-ja) és hőmérséklete. Ezt szervezet ionkoncentrációjával megegyező sótartalmú 0.9% os NaCl (konyhasó) oldat, illetve még pontosabban a 0.1M pH=7.4 PB biztosítja.

Egy hétvégére aztán beköltöztünk az Intézet egyik laborjába (köszönet érte Acsády Lászlónak, Bokor Hajnalkának és Faddi Krisztinának).

A fixálást az egerek altatásával kezdtük. Először altatógázzal elkábítottam őket, hogy nyugodtak legyenek és ne érezzen fájdalmat amikor a hasüregükbe adtam az altatót. A mélyen alvó egerek keringési rendszerét azután fizsóval, majd fixálóval öblítettem át. Ez egy 40 peres folyamat, melynek végére az agy radírgumi keménységűvé válik. Ez kell ahhoz, hogy később vékony metszeteket tudjunk vágni az agyból. Az agyakat finom ollók és csipeszek segítségével a fiatal kuatópalánták kivették a koponyából és elkezdtük kimosni belőlül a fixálót többször cserélt 0.1 PBvel. Aki résen van láthatta a szövegből, hogy a diákok csak azután nyúlhattak az állatokhoz miután azok már nem éltek. Az EUban és Magyarországon is szigorú szabályok szerint szabad csak állatkísérleteket végezni. Csak azok dolgozhatnak állatokkal akik megfelelő vizsgával és engedélyekkel rendelkeznek, ismerik azt hogyan kell az állatokkal humánusan, stresszmentesen dolgozni.

A következő lépés az teljes egér agyak lemetszése volt. Mivel kérdésünk az, hogy az egér teljes agyában hol találhatók meg a PV és GlyT2 sejtek és nyúlványaik, ezért az egész agyat kell metszenünk. Egy egér agy kb 1.5 cm hosszú. Rutinszerűen nem vág az ember vastagabb metszeteket mikroszkópiára, mint 100 mikrométer, mert ha túl vastagok a metszetek a mikroszkópok nem képesek átfókuszálni őket, illetve nehéz a festésük és az optikai tulajdonságaik sem jók. Azaz nekünk egerenként kb. 150darab 100 mikronos metszetet kellett vágnunk. Hogy egy-egy sorozatban kezelhető mennyiségű metszetünk legyen, állatonként 4-4 üvegbe szedtük fel a metszeteket körkörösen. Így egymástól 400 mikronra levő koronális szeletek kerültek egy-egy üvegbe az agy összes részéről.
A metszeteket egy Vibratome nevű szerkentyűn készítettük, melynek asztalkájára kell felragasztani az agyakat és a 100 mikrométeres lépésekben emelkedő agyak felszínéről egy gyorsan rezgő borotvapenge választja le a metszeteket. Azokat finom ecsettel helyezzük el a pufferrel töltött  üvegcsékbe, figyelve a helyes sorrendre. Minden diáknak jutott a mókából és ügyesen, ha elsőre nem is gyorsan lemetszették az agyakat.
Ezután jött az uncsi rész. Az üvegcsékben úszkáló metszetekről egy Pasteur-pipettával óvatosan leszívjuk a puffert és új, tiszta puffert teszünk rá. Ezt a lépést 10 percenként 4x megismételjük, hogy az immunfestést ne tegye tönkre a metszetekben maradt aldehid.
Folyt köv.

Szerző: Gulyás Attila

Az alaposan pufferrel (0.1M PB, pH=7.4) kimosott metszeteknél hagytuk abba a beszámolót. De ez egy olyan lépés, ahol a folyamatot pihentetni lehet, ha úgy jön ki. A metszetekből kimostuk az aldehidet, ülnek a fehérjéknek tetsző pH-n és ionkoncentráción, nem sietnek sehova. Ha hosszabb ideig tervezzük tárolni a metszeteket, mielőtt tovább indulnánk, akkor 0.05%os NaN₃-at, azaz nátrium azidot kell az oldatokhoz adni.

Ez a ciánhoz hasonlóan bekötődik a mitokondriumokban a légzési lánc enzimjeinek oxigén kötő rézébe és ezért remek gomba és egyéb mikroba ellenes szer. A ciánnál kevésbé veszélyes, minimális figyelemmel veszély nélkül használható (nem szabad nagyobb mennyiséget meginni).

Az állatonkénti 4 üvegből kettővel így is bántunk, eltettük őket tartalékba. A másik két üveg közül az egyikből a metszeteket immunfestés nélkül tárgylemezekre tettük (hamarosan elmondjuk hogyan), hogy megnézhessük milyen a sejtekben a GFP jel. A másik üvegcséket pedig tovább vittük a kettős immunfestére. Azért kettős, mert egyrészt felerősítjük a GFP jelet, hogy minden transzgént kifejező sejtet elcsípjünk, másrészt a két törzs esetében még egy másik anyag ellen is festünk, hogy összevethessük a transzgén jelölés mennyire fed át bizonyos sejtekben található anyagokkal (lásd előző bejegyzés).
Az immunfestés alapjairól már beszéltünk az #agytechnikák rovatban, de itt a részletekbe is belemerülünk, hogy érthetőek legyenek a lépések amiket végrehajtottunk.

Először leültünk és végiggondoltuk, hogy amennyiben a GFP-t, a parvalbumint és a calbndint akarjuk megjeleníteni milyen antitesteket kell használnunk, pontosabban milyen elsődlege és másodlagos antitesteket. Ez egy bonyolult játék, mert a két egyszerre vizsgálni kívánt anyag ellen más-más állatban kell elsődleges antitestet termelni, mert majd ezeknek az állatoknak az az antitestei ellen termeltetett (eltérő színű fluorescens festéket hordozó) másodlagos antitestet kell használnunk.

Így született az abrakadabra ami a jegyzőkönyvben található:

Pimer antitest keverék:
1/2 és 3/2 üvegre: AL071 chicken anti-GFP 1:5000 + AL066 rabbit anti-PV 1:2000 1-1ml
4/2 és 5/2 üvegre: AL071 chicken anti-GFP 1:5000 + AL083 guinea pig anti-Calbindin 1:2000 1-1ml
Secunder antitest keverék:
1/2 és 3/2 üvegekre: S110 Goat anti-Chicken Alexa488 1:500 és S255 Donkey anti-Rabbit Cy3 1:500
4/2 és 5/2 üvegekre: S110 Goat anti-Chicken Alexa488 1:500 és S258 Donkey anti-GuineaPig Cy3 1:500

De mit jelent pl. az: AL071 chicken anti-GFP 1:5000? Az jelenti, hogy a nyilvántartásunkban az AL071 es számot viselő, csirkében a GFP ellen termeltetett antitestet ötezerszeres hígításban kell használnunk. Ezt az egyik transzgénikus törzs esetében a z AL066os kódot viselő nyúlban a Parvalbumin ellen termeltetett antitestet kell keverni kétezer-szeres hígításban, a másik törzsnél pedig a tengerimalacban Calbindin ellen termeltetett antitestet ugyanebben a hígításban.

A második lépcsőben pedig a GFPt jelölő csirke antitesthez, kecskében csirke antitestek ellen termeltetett, zöld fluoreszcens festékkel (Alexa 488) jelölt antitestet kötünk. A megfelelő állat esetében ehhez keverjük a másik antigént felismerő antitestet felismerő pirossal jelölt (Cy3) antitesteket.

Nem gyötröm a hallgatóságot tovább, aki követni tudta kitalál melyik állat, stb.

Ez persze nem ilyen egyszerű. Az antitesteknek, mint minden fehérjének megvan az a rossz szokása, hogy kb. bármihez hozzátapad, így az agyszövethez. Ahhoz, hogy az antitestek hibás tapadását lecsökkentsük, a metszeteket az első lépésben tömény fehérjeoldatba áztattuk. Ez esetünkben 10%os szamár vérsavó volt (már megint egy újabb állat). Aki szemfüles láthatta a jegyzőkönyvben, hogy itt még 0.5% Triton-X100 is volt az oldatban. Az meg minek? Nos ezekben a jól fixált agyszeletekben a sejthártyák köszönik jól vannak és megakadályozzák a nagyobb molekulák, mint pl. az antitestek sejtbe jutását. A 0.5% Triton-X100 egy detergens, egy mosószer, melye a zsíros sejthártyákat kilyuggatja. Ezután könnyebben diffundálnak reagenseink és metszetünkben jelentősen mélyebbre jut be az immunfestés. Ezt a keveréket 40 percig hagytuk rajta a metszeteken és utána öntöttük nyakon a megfelelő antitest keverékekkel.

Ezután jön a türelmes anatómus várakozás, mert a diffúzió lassan dolgozik. Legalább 2-3 órát, de inkább egy napot kell hagyni dolgozni a rendszert. Ezalatt, mint a legtöbb fázis alatt a metszeteket rázógépen rázattuk finoman, hogy elősegítsük a diffúziót.
Úgyhogy itt ugrunk egyet másnapra, amikor is fentről ismert 4x10 perces pufferes mosással lemostuk az elsődleges antitesteket és a metszeteket újabb napra nyakon öntöttük a másodlagos antitest keverékkel. Itt már nem kellett magas fehérjeoldattal blokkolni a tapadást, mert azt egyszer már megtettük.

Még egy nap és jött az utolsó 4x10 perces pufferes mosás. Ezután érkezett el az igazság pillanata, a metszetek tárgylemezre helyezése, lefedése és megkukkantása a mikroszkópban.

De ez majd legközelebb…

Szerző: Gulyás Attila

 Az EEG és a viselkedés összefüggése I. bejegyzésünkre érkezett egy kérdés, amire inkább egy külön #agykérdések bejegyzésben válaszolok. 

Nos  a földelés kérdése meglehetősen bonyolult, mint azt a Mézga család rajzfimsorozatból is megtudtuk, ahol a legjobb földet Blöki füle adta. 

Az első fontos dolog amit tudni kell, hogy potenciált csak két pont között tudunk mérni. Ha a potenciál mérőnk egyik végét bedugjuk valahova, a másik vége meg lóg a levegőben, akkor semmilyen értelmes eredményt nem tudunk kapni. MIndig csak potenciál különbséget lehet mérni, a különbséghez meg két helyen kell mérni. Azaz két elektródát két helyre...

Ettől egyszerűbb is meg bonyolultabb is lesz az életünk egyszerre. Egyszerűbb, mert ha jó helyre tesszük az egyik elektródánkat (akit kikiáltunk földnek, hogy mi az. lásd iziben), akkor sok kellemetlen elektromos zajtól megszabadulhatunk. Bonyolultabb pedig azárt, mert sosem abszolút potenciál értéket mérünk, hanem mindig valakihez viszonyítunk. Ha a viszonyítási pontunk (feszültségünk) mozog, akkor nehéz értelmezni mit látunk.

Ha két elektrofiziológus találkozik, nagy eséllyel arról fognak beszélgetni órák hosszat, kinek mi a földelési technikája, és hogy az épp most működik-e, vagy nem? Hasonlóan a kismamákhoz, akik gyermekük székletéről és hihetetlen szellemi képességeiről tudnak vég nélkül beszélgetni.

Világosodjunk meg először is abban a témban, hogy mi az a föld, a földelés? Ha egy egyszerű rendszer, pl egy elem feszültségét akarjuk megmérni, akkor viszonylag egyszerű két mérési pontot választani, az elem két pólusát. De mi van ha rendszerünk bonyolult, tele van elágazásokkal és elektronius elemekkel. A mérnökök arra jutottak, hogy ki kell választani egy pontot, és ehhez kell viszonyítani a mért feszültségeket. Praktikus, ha a rendszert tápláló, feszültséget adó elem, táp, stb. negatív pólusát tekintjük ennek a hivatkozási pontnak, mert akkor ami ennél pozitívabb ott pozitívat, ami ennél negatívabb ott negatívat fogunk mérni.  Egy kapcsolási rajzot rajzolhatunk úgy, hogy alul fut  a negatív drót és attól felfelé fut a pozitív, a kettő között pedig az elektronikai elemek. Az alsó a földhöz közelebb van, legyen ez a föld :)

De nem csak ezért hívják földvezetéknek az egyik drótot. Ha azt karjuk, hogy két elektromos szerkezet jól é biztonságosan tudjon együttműködni, akkor biztosítani kell, hogy közös potenciál-nyelven beszéljenek. Ezt úgy lehet elérni, hogy mindkettőnek az alapját, megegyezés szerint a negatív potenciálú drótját, összekötjük, mert ettől kezdve ezek közös potenciálon lesznek és a rendszerek pozitív elemeinek értelmezhető lesz az értéke.

Ha sok kütyünk van kicsit bonyolult mindnekit egymáshoz kötni (bár egy elektrofiziológiai labor vagy egy számítógép szerverszoba mutatja, hogy lehetséges), jóval egyszerűbb ha mindnekit egy nagy közös, könnyen elérhető ponthoz, a Földhöz kötünk! Ezt hívjuk referencia földnek és nem keverendő össze a védő földeléssel, aminek más a szerepe.

Amikor két elektromos kütyüt összekötünk, pl HDMI, USB vagy RCA kábellel akkor a dugók külső részé na legmasszívabb fémköpenhez van kötve a föld, ahhoz képest mennek a jelek a többi dróton.

A Föld persze csak akkor jó föld, ha jó a vezetőképessége, azaz a felépülő feszültségek kis ellenálláson keresztül jól el tudnak folyni és ezéltal a földelt dolgok gyorsan azonos potenciálokra kerülnek. Egy komoly referencia föld elkészítése alapos meló, sokba kerül. Le kell ásni egy fémhálót a földbe jó mélyen, hogy érintkezzen a talajvízzel ami jól vezeti az áramot. Mindeközben arra is vigyázni kell milyen fémekből állnak a vezetékek, mert csatlakozásuknál galván elemek képződhetnek, amik belekavarnak az egészbe. Érzékeny elektronikai rendszereket használó intézményekben külön, precízen leföldelt földhálózatot építenek ki.

A Macska-jaj címú korszakalkotó filmalkotásban volt egy jelente, amikor meg kellett locsolni a vilanypóznát, hogy jó legyen a telefonvonal. Ez nem vicc, valóban komoly, fizikán alapuló észrevétel. Ha a föld vizes jobba vezeti az áramot és a föld felé jobban földelődik a jel. 

Az agyi jeleket mérő elektrofiziológusoknak jobb esetben millivoltokat (egész sejt intracelluláris elvezetés), rosszabb esetben mikrovoltokat (koponyatetői EEG, mezőpotenciál elvezetés, single unit elvezetés) kell mérnie. Sajnos a nagyfeszültségű elektromos hálózat (anyira azért nem nagy, 240V), ami épületeinket behálózza és műyzereinket eteti komoly zajforrás. A drótokban rezonáló 50Hz-es áram, 52Hz es elektromágneses hullámokat bocsájt ki, ami egy vezetőben (pl. egy mérőműszer drótja) 50Hz-es feszültségingadozást kelt. Ami ugyan nem nagy, de összemérhető a biológiai jelek méretével és ezért egy elektrofiziológus számára nagyon zavaró. De az elektromos zajoknak más fajtái is vannak. Egy kapcsoló átbillentésekor keletkező szikra, egy fénycső bekapcsolása, vagy egy LED fényforrás nagy frekvenciájú (nekünk láthatatlan) ki-be kapcsolása mind eltérő zajokat  produkál. 

Ha rosszul helyezzük a két feszültségmérő végpontot akkor ezek bizony mind látszani fognak méréseinkban és találgathatunk mi a jel és mi a zaj. A periodikus 50Hz-es zajt viszonylag egyszerű utólag kiszűrni, de a szabálytalan zajokkal nehéz boldogulni.

Mi a megoldás? 

Ha a külső zajoktól meg akarunk szabadulni, akkor érdemes a mért rendszer földelését és a mérő elektródát egymáshoz közel tenni, mert a külső zajok erőssége és alakja a tér egymáshoz közeli potjain egyforma, távoli pontjain pedig eltér egymástól. Ha közel a két pont, akkor mindkettőn egyszerre változik a zaj és mivel különbséget számolunk, bármekkora is a zaj, ha értékük közeli, különbségük közel zérus. Azaz, ha egy túlélő szeletpreparátumból mérünk, akkor a szeletfenntartó kamra tápoldatába teszünk egy földelő elektródát, és ehhez képest mérjük az idegsejtek vagy a mezőpotenciál jeleit. Ha élő állatból vezetünk el, akkor általában a koponyacsontba erősített csavarra földelünk, ehhez képest mérjük a potenciálokat. De pl. ilyenkor ha az állat elkezd rágcsálni, a rágóizmok elektromos potenciáljai nem egyformán kerülnek rá a földelésre és a mérő elektródára (mivel a közelből erednek és térben gyakran változnak) és az izompotenciálok belekeverednek a mért jelbe.

Ugye valami olyan pontra kell tenni a földelést, amitől nem várjuk el, hogy saját jelet produkál, hiszen ez vonódik ki a mérőelektróda jeléből. Ezért választjuk a koponyacsontot vagy tápoldatot, nem pedig egy agyterületet vagy egy idegsejtetet a szeletben. Mert ha a referencia elektródánk az egyik idegsejtben van a méró meg egy másikban akkor mért különbségből nem tudjuk eldönteni melyik idegsejtből származik a jel.

Ha jó helyen van a referencia elektródánk akkor aztán tetszőleges számú mérőelektródát viszonyíthatunk hozzá.

Az emberi agyat vizsgáló EEG elvezetések esetében még ennél is bonyolultabb a helyzet. Egyrészt nem illik a vizsgált személy koponyájába csavarokat hajtani, hogy arra, mint indifferens pontra földeljünk, másrészt a vastag emberi koponyán és hajon keresztül már csak mikrovoltok szivárognak ki. Azaz a sokcsatornás emberi, klasszikusan klinikai EEG vizsgálatok esetében azt a megoldást választották, hogy az egyik elektródát tekintik referencia pontnak és a többit ehhez számítják. Ez az EEG masinákon állítható és az EEG elvezetésekre rávezetik, hogy melyik elektródát használták referencia pontnak. Ennek az előnye az hogy viszonylag jól el lehet tüntetni a külső zajokat. Hátránya, hogy beavatott tudás kell az EEG eredmények kiértékeléséhez, hiszen minden csatorna jeléhez negatív előjellel hozzáadódik a referencia csatorna jele. A helyes referenciapont kiválasztásának külön tudományága és művészete van és még ezt elsajátítva is rutin és évek kellenek ahhoz, hogy valaki helyesen értékeljen egy klinikai EEG-t. Képzeljük el valaki epilepsziás gócot keres, ami egy elektróda alatt ad jelet. Ha történetesen ez a referencia elektródánk alatt van, akkor az epilepsziás jel minden csatornán megjelenik. Ezt persze egy rutinos elektrofiziológus észreveszi, de azért egy csomó jel értelmezése meglehetősen nehézkes. Itt egy példa látható mi történik ha rossz referencia elektródát választunk.

Vannak még más megoldások is zajtalanításra. Például a mérőrendszert egy Faraday-kalitkába kell helyezni, azaz körül kell venni egy földelt fémhálóval, mert az nem engedi át az elektromágneses hullámokat. Klinikai EEG szobákba "gyárilag" építenek ilyet. Glettelés és festés előtt a szoba falait rézhálóval tapétázzák. Másik megoldás, a kábeleket kívúlről egy földeléssel körbevenni, ilyenek a magas frekvenciás jeleket továbbító kábelek, pl a kábeltévé drótja vagy az oszcilloszkópok és erősítők RCA kábelei (ne, feltétlenü őket védik, ez a földelés a zavaró jelek kibocsájtását is megakadályozza). Egy elektrofiziológus vagy fizikus laborban az sem ritka látvány, hogy leföldelt alufólia csíkokat tekergetnek a berendezések köré. Tapasztalataim szerint ez nem áll messze hatékonyságnan a woodoo babák használatától. Néha működ9k, néha nem, a legfelháorítóbb, hogy az ember nem tudja mitől működött vagy nem.

Szerző: Gulyás Attila

Az #agytecnikák rovatban, meglehetősen régen, körbejártuk az anatómia és fiziológia módszereit. Itt az ideje, hogy a molekuláris/genetikai módszereket is bemutassam. Jó nagy falat. A régi, klasszikus technikáktól indulok, és eljutok a legmodernebb, 2020–2025 között megjelent eljárásokig. Hatalmas a fejlődés, számos régi anatómiai és elektrofiziológiai módszert is leváltanak már ezek a technikák. Először egy kicsit ámokfutás szerű lajstrom következik a technikákról, majd részletesebben is elmerülünk a fontosabb módszerek működésében és lehetőségeiben.

Az idegrendszer idegsejtekből és gliasejtekből áll. Lévén sejtek, a bennük lévő DNS információ tartalma határozza meg működésüket. A kisebb-nagyobb, sejtosztódáskor bekövetkező másolódási hibákból eredő, mutációkat leszámítva, minden egyes sejtünkben ugyanazt az infomációt hordozza DNS-ünk. Mégis szervezetünkben rengeteg eltérő működésű sejttípus alkot különböző szöveteket.
Akkor most ez hogy is van? Ugyanaz az információ, mégis más a működés?

A megoldás az, hogy a sejtekben nem csak genetika, hanem epigenetika is működik. Azt hogy egy sejtben milyen gének lesznek bekapcsolva a genetikus és epigenetikus faktorok együtt határozzák meg.

Amikor egyetemre jártam (régen), akkor azt tanultuk, hogy a biológia centrális dogmája ez:

DNS-->RNS-->fehérje

Azaz, a DNS-ről a transzkripció során mRNS keletkezik, amiről a transzláció során fehérjék készülnek. No ez az elképzelés időközben rengeteg extra szabályozással és csavarral gazdagodott.

Kezdetben úgy gondoltuk a minden sejtünkben ugyanazt az információt hordozó DNS különböző szakaszairól csak akkor íródik át információ, ha az adott szakaszok (gének) szabályozó régióihoz a megfelelő transzkripciós faktorok kötődnek vagy nem kötődnek (mert hogy van pozitív meg negatív szabályozás is). Aztán kiderült hogy vannk epigenetikai mechanizmusok is, melyek olyan sejten belüli szabályozások, amelyek nem változtatják meg a DNS szekvenciáját, mégis tartósan befolyásolják, hogy mely gének aktívak és melyek hallgatnak. Ide tartozik a DNS-metiláció, amely kémiai jelölésekkel „lezárhat” génszakaszokat, valamint a hisztonmódosítások, amelyek meghatározzák, mennyire hozzáférhető a DNS a leolvasó fehérjék számára. Fontos szerepet játszanak a kromatin szerkezeti átrendeződései is: a DNS térbeli csomagolása eldönti, hogy egy gén fizikailag elérhető-e az átíráshoz. Emellett különböző nem-kódoló RNS-ek is képesek finoman szabályozni a génkifejeződést azáltal, hogy gátolják vagy irányítják az RNS-ek sorsát. Ezek az epigenetikai jelölések információt hordoznak a sejt múltjáról – például fejlődési döntésekről, környezeti hatásokról vagy stresszről –, és sejtosztódáskor részben továbböröklődnek, így stabil sejtazonosságot biztosítanak. 
Egy sejt működését, funkcióját, tehát az határozza meg, hogy citoplazmájában, de leginkább sejtmagjában milyen transzkripciós faktorok vannak, hanem hogy milyen volt korábbi sorsa, milyen ingerek érték. 
Kicsit olyan, mint egy szakácskönyv és a szakács által benne hagyott cetlik és jegyzetek, valamint a spájz tartalma közötti összefüggés az ebéd meghatározásában. Sok háztartásban meglehet ugyanaz a szakácskönyv, ugyanazokkal a receptekkel, de az egyik helyen a Narancsos kacsa és Gyömbéres körtés nyúlgerinc mellett vannak a szamárfülek, meg a saját változatokat leíró jegyzetek, a másik családban pedig a Pacalpörkölt és a Vesevelő mellett. És ehhez jön még, hogy a spájzban miből válogathatunk az ebéd elkészítéséhez.

Amikor egy sejt osztódik leánysejtjeinek átadja transzkripciós faktorait és epigenetikusan módosított genomját, mint ahogy a nagymama a szakácskönyvet az unokájának a saját jegyzeteivel. Osztódáskor a faktorok átadása gyakran aszimmetrikus, azaz a két leánysejt más faktorokat visz magával és emiatt szakosodik (specializálódik) más feladatok megoldására. A leánysejtekben ezért eltérő DNS szakaszokról íródnak át mRNS-ek, melyek aztán eltérő feladatú fehérjék íródnak át. Ezek egy része valamilyen anyagcserében, vagy sejtalkotó részek felépítésében szerepet játszó fehérje, más részük transzkripciós faktor.
Ha egy sejt működését akarjuk megérteni, akkor nem DNS-ét, hanem a sejtekben az adott állapotban található fehérjéket kell megvizsgálnunk. A fehérjék azonosítása azonban nem egy egyszerű feladat (erről szól a proteomika). Ennél sokkal egyszerűbb a sejtben az adott pillanatban átíródó fehérjéket kódoló mRNS-ek vizsgálata, ezért ezt is teszik a kutatók. Ennek oka, egyrészt, hogy míg a fehérjékben 24 aminosav van, addig az RNS-ben csak 4 bázispár (könnyebb az alkotóelem sorozat meghatározása), a másik, hogy a DNS és RNS molekulák funkciójukból (és felépítésükből) fakadóan (információ másolás és továbbítás) könnyen sokszorosíthatók és ezáltal az egyes sejtekből kinyerhető nagyon kevés mennyiségű fehérjénél könnyebb dolgozni a kevés mennyiségű, később megsokszorozott RNS mintákkal. De mint láttuk nem csak az mRNS készlet befolyásolja milyen fehérjék kellenek, hanem az epigenetikus faktorok is.

A nagy előrelépés ami az elmút 5 évben történt, hogy a legújabb módszerek az összes szabályozó elem, akár együttes, vizsgálatára alkalmasak .

Az ámokfutást a Klasszikus módszerek lajstromozásával kezdjük:

Klasszikus (több évtizede használt módszerek)

analitikus és manipulatív módszerek:

a) a DNS vizsgálatával megmutatják hogy az adott sejt vagy szövet milyen genetika információt hordoz, vannak-e mutációk;

b) az átírt RNS vizsgálatával az aktuális működést és szabályozást vizsgálják (milyen gének vannak bekapcsolva és hol);

c) a fehérjék elemzésével pedig megnézik valóban mi történik az egyes sejtekben, szövetekben.;

d) genetikai módosításokkal ki-be kapcsolnak géneket, reporter (jelző) géneket használnak, melyek megmutatják hol és mikor kapcsol be egy gén és annak mi a hatása.

I. Molekuláris analitikus módszerek:
1. PCR és qPCR: RNS alapú, génexpresszió mennyiségi mérésére, splice variánsok, mutációk kimutatására alkalmas
2. In situ hibridizáció (ISH): RNS lokalizációja szövetben, neuron- és gliasejt-típusok meghatározása
3. Southern és Northern blot: ma már ritkább, de alapvető eljárások génvariációk (DNS) és kifejezett RNS-analíziséhez
4. Western blot: fehérjék kimutatása, foszforiláció és más módosítások elemzése

II. Génexpresszió és fehérjeexpresszió manipulálása:

megváltoztatják a gének kifejeződését, ki-be kapcsolható gének, illetve létrehozhatók új géneket kifejező sejtek, élőlények, ezek lehetnek csak jelző (reporter) gének, fehérjék, de funkciót is megváltoztathatnak vagy betegségmodellként használhatók.
5. Expressziós technikák: génbeültetés plazmidokkal, promóter analízis, reportergének (GFP, LacZ)
6. Transzgénikus állatok (régi módszer, de aktív): random integráció, neuron-specifikus promóterek (CamKII, Synapsin)
7. Knock-out és knock-in modellek (pre-CRISPR): homolog rekombinációval ES sejtekben, időigényes, de ma is létező megközelítés bizonyos célokra
8. RNA interference – siRNA, shRNA: géncsendesítés sejtkultúrában és in vivo, vírusvektorral vagy elektroporációval
9. Antisense oligonukleotidok (ASO-k): specifikus génlehallgatás, klinikumban is (SMA kezelés)

A következő bejegyzésben az utóbbi 5 évben kifejlesztett, szerintem lenyűgöző trükköket alkalmazó módszerek listázását folytatjuk.

Szerző: Gulyás Attila

Az előző bejegyzésben lajstromozott technikákhoz képest számos területen történt jelentős fejlődés:

• c) az „omics” technikák lehetővé teszik teljes rendszerek összefüggéseinek megértését;
• d) térbeli térképezési technikákkal teljes aktiválódó gén és fehérje kifejeződés-térképek készíthetők;
• e) a sejtvonalak és agyterületek fejlődését tudjuk befolyásolni;
• f) a nukleinsav és fehérje kölcsönhatások vizsgálatával a genetikai szabályozó hálózatok deríthetők fel;
• g) a genetikailag kódolt optikai érzékelő és ingerlő fehérjék lehetőségei jelentősen fejlődtek (erről már írtunk és még fogunk írni korábban)és végezetül
• h) az extrém multiomics, ahol számos nagy áteresztő képességű módszert kombinálnak teljes szabályozórendszerek vizsgálatára.

Azaz, képesek vagyunk hatalmas mennyiségű adatot gyűjteni 3D-ben, egész szervezetek, agyak, funkcionális állapotáról, szabályozó rendszereiről vagy megbetegedések esetén a változásokról. Színes, szagos, multimédiás vizsgálatok lettek elérhetők. Ezekhez persze komoly adatfeldolgozó háttér is kell, megfelelő softwarek és adatanalízis módszerek.

És akkor a meglehetősen hosszú lista, melyből a legelterjedtebb módszereket részletesen is bemutatjuk majd az elkövetkező blogbejegyzésekben.

III. Modern genetikai szerkesztés és génbeviteli technikák: lehetővé teszik genetikai információ célzott bejuttatását sejtekbe, egyedekbe, pontos genetikai beavatkozásokat tesznek lehetővé, pl. mutációk kijavítását vagy betegségmodellek elkészítését.

• 10. CRISPR-Cas9 / Cas12 / Cas13 rendszerek: génkiütés, pontmutáció, javítás
  betegségmodellek létrehozása, in vivo génterápia alapja
• 11. Base editorok (A→G, C→T átírás): DNS kettős-törés nélkül precíz pontmutációk beépítése, idegrendszeri betegségek modellezése
• 12. Prime editing: „molekuláris szövegszerkesztő”, akár több bázis cseréje / beszúrása / törlése is lehetséges, sejttoxicitás alacsony
• 13. Cre-loxP, Flp-FRT rekombinációs rendszerek: feltételes (conditional) kiütés, sejttípus-, életkor- vagy agyterület-specifikus genetikai módosítás, neurobiológia egyik alapeszköze
• 14. AAV, lentivírus, rabies vírusvektorok: génbevitel célzott sejtekbe
  transz-szinaptikus tracerek (RV, HSV), optogenetikai fehérjék expressziója
• 15. Transzpozáz alapú génbevitel (Sleeping Beauty, PiggyBac): stabil integráció, nagy méretű transzgén egyszerű bevitele

IV. Sejttípus- és környezet-specifikus génmanipuláció: gének kifejeződésének vagy fehérjék működésének célzott, időzített ki vagy bekapcsolását teszik lehetővé. Az agy embriológiai folyamatai és hálózatok működés vizsgálható ezekkel.

• 16. DREADD rendszer (chemogenetika): Gi, Gq, Gs jelátviteli utak mesterséges aktiválása, viselkedési és hálózatszintű vizsgálatok
• 17. Optogenetika (Channelrhodopsin, Halorhodopsin, Chrimson, stb.)
  fényvezérelt aktiváció/gátlás: neuronhálózatok dinamikájának feltárása
• 18. Tet-On/Tet-Off rendszerek: időzített génexpresszió, krónikus vs. akut hatások elkülönítése
•  

V. Nagy áteresztőképességű molekuláris profilalkotás (omics): Ezekkel a módszerekkel sejtek vagy agyterületek teljes RNS-, fehérje-, transzkripciós faktor- kifejeződését, epigenetikus-, metabolikus- állapotát lehet meghatározni, gyakran térképszerű, térbeli lokalizációval. Hihetetlenül felgyorsítják a sejttípusok felfedezését és lokalizációját valamint funkcionális és fejlődési sajátságaik felderítését. Lehetővé teszik a fejlődés során a génkifejeződés és genetikai szabályozás mintázatainak felderítését. Nem megcélzott dolgokra kérdeznek rá, hanem mindent azonosítanak és a mérést követő elemzés során bukkannak fel fontos új összefüggések, mechanizmusok.

• 19. Bulk RNA-seq: agyterületek átlagos génexpressziója, fejlődési és betegségi különbségek vizsgálata
• 20. Single-cell RNA-seq: egyedi neuronok transzkriptomja, új sejttípusok felfedezése (pl. SOM, VIP alcsoportok)
• 21. Spatial transcriptomics: lokális génexpressziós térképek agyszeletekben, sejttípus, réteg és funkcionális környezet összekapcsolása
• 22. ATAC-seq, single-cell ATAC-seq: kromatin hozzáférhetősége: mely gének „nyitottak”, epigenetikai állapotok stresszre, tanulásra, drogokra
• 23. CUT&RUN / CUT&Tag: transzkripciós faktorok és epigenetikai markerek kötődése, sokkal érzékenyebb, mint klasszikus ChIP-seq
• 24. ChIP-seq: fehérje–DNS kölcsönhatások feltárása, fejlődési faktorok, CREB, MEF2, c-Fos stb.
• 25. Proteomika: tömegspektrometriás fehérjekimutatás: foszforilációs térképek, szinaptikus proteomika
• 26. Lipidomika, metabolomika: membránösszetétel, neurolipidek, glia–neuron interakciók metabolikus profilja

VI. Molekuláris anatómiai és sejttérképezési technikák: Kimondottan a molekulák térbeli elhelyezkedésének vizsgálatára, 2D és 3D szövettérképezésre és elemzésre fejlesztett módszerek. A mérést követő számítógépes megjelenítés során számtalan faktor kölcsönös előfordulását lehet velük megvizsgálni.

• 27. RNAscope: ultraspecifikus RNS in situ hibridizáció, ritka transzkriptumok kimutatása egyetlen sejten belül
• 28. CLARITY, iDISCO, uDISCO: átlátszóvá tett agyak, 3D immunfestés és génexpresszió vizsgálat
• 29. Multiplex immunhisztokémia: több tucat fehérje vizsgálata egyetlen agyszeleten, sejttípusok és szinaptikus mintázatok azonosítása
• 30. BARseq, MAPseq: molekuláris vonalkóddal ellátott projekciós térképezés
  axonális célpontok DNS-alapú kódolása

VII. Molekuláris manipuláció és sejt-sors befolyásolása: Idegsejt és agyfejlődést vizsgáló eljárások. Hogyan fejlődnek a sejtvonalak és alakulnak ki az egyes agyterületek.

• 31. Lineage tracing (sejtvonal-követés): fejlődés során merre vándorolnak a neuronok,  CRISPR-vonalkódolás (homing CRISPR barcoding) modern változatban
• 32. iPSC technológia: humán bőrsejtekből idegsejtek, asztrociták, oligodendrociták előállítása, betegspecifikus modellek
• 33. Organoidok (mini-agyak): 3D agyi szövetmodellek, fejlődés, betegségek, droghatások vizsgálata
• 34. In utero elektroporáció: fejlődő egérmagzat agyába juttatott DNS, réteg- és sejttípus-specifikus expresszió

VIII. Nukleinsav- és fehérjeinterakciók feltárása: A genetkai szabályozó hálózatok vizsgálhatók.

• 35. RNA-bindig protein mapping (CLIP-seq, HITS-CLIP, iCLIP), mely fehérjék milyen RNS-t kötnek, poszttranszkripciós szabályozás
• 36. Proximity ligation assays (BioID, APEX): fehérje–fehérje és fehérje–RNS közelítő interakciók térképei, sejten belüli mikrodomének feltárása (axon, dendrit, spine)
• 37. Ribosome profiling (Ribo-seq): mely mRNS-eket fordít le a riboszóma → valódi fehérjetermelés

IX. Optogenetikai módszerek és optikai szenzorok: Transzgénikus technológiákkal előállított feszültség, Ca, inegületátvivő anyag, metabolikus állapot, lipidanyagcsere-érzékelő molekulák, illetve serkentő és gátló opszinok. Ezek kombinációjával egyszerre lehet mérni és befolyásolni az agyi degsejt jelintegrációját és a hálózatokműködését. Illetve vizsgálni az ingerüetátvjvő anyagok felszabadulását és a sejtek anyagcsere állapotát. Az utóbbiakró hamarosan részletesen írunk.

• 38. Kódolt Ca²⁺-szenzorok (GCaMP-verziók): neuronpopulációk működésének optikai követése
• 39. Kódolt feszültségszenzorok (GEVI-k): dendritikus integráció és AP-dinamika vizsgálata
• 40. All-optical physiology: optogenetika + Ca/voltage imaging kombinációja stimuláció és mérés egyszerre

X. Rendszerbiológia (Systems Biology) és Extrém modern multiomics: A rendszerbiológia az élő rendszereket komplex hálózatokként vizsgálja. Nem egyetlen génre vagy fehérjére fókuszál, hanem arra, hogyan hatnak egymásra: génhálózatok, jelátviteli utak, sejt-sejt kommunikációs csatornák, anyagcserefolyamatok.
Az alapelv: a rendszer több, mint az alkotórészek összege. Az idegtudományban ez azt jelenti, hogy például a stressz, a tanulás, vagy a drogok hatásait nem egy-egy molekula szintjén vizsgáljuk, hanem az egész sejtprogram és hálózat változásait elemezzük.
Itt számos nagy áteresztőképességű módszert kombinálnak, hogy egyetlen sejtben nézzék a szabályozó rendszerek összefüggéseit vagy egyes gének működésének megzavarását követő tovább gyűrűző változásokat figyelve szabályozó (jelátviteli, genetikus)- és anyagcsere hálózatokat derítsenek fel.

• 41. Multiomics single-cell megközelítések: scRNA-seq + scATAC-seq kombináció
  génexpresszió + epigenetika egyetlen sejten
• 42. Spatial multiomics: térbeli RNS, fehérje és epigenetikai rétegek összeolvasztása, agyszelet „molekuláris térképe”
• 43. CRISPR interference (CRISPRi) és CRISPR activation (CRISPRa): géncsendesítés vagy aktiválás DNS-vágás nélkül, stabil, finomhangolt génszabályozás neuronokban
• 44. Perturb-seq: CRISPR-alapú génzavarás + single-cell RNA-seq, funkcionális genomikai hálózatok feltárása
• 45. Mosaic analysis (MADM, MARCM): sejtspecifikus genetikai mozaikok létrehozása, fejlődés és funkció összekapcsolása

És ígérem itt az ámokfutás vége. Kiemelünk jónéhány sziporkázó technikát és elmerülünk részleteikben!

Szerző: Gulyás Attila

Southern, Northern és Western blot: a molekuláris információ három lépésének klasszikus vizsgálati módszerei

A különbség köztük az, hogy melyik molekulatípust vizsgálják: a Southern blot a DNS-t,  Northern blot az RNS-t, a Western blot pedig a fehérjéket méri. Mindhárom technika úgy működik, hogy a mintát először molekulaméret szerint szétválasztják,  általában gélelektroforézissel, majd a molekulákat egy membránra viszik át, ahol egy specifikus próba vagy antitest segítségével kimutatják a keresett célt.

Ha precízek akarunk lenni több féle módon is lehet molekulákat méret alapján szétválogatni. Elektroforézissel és gél szűréssel.

Az elsőt a technikai nyelvben futtatásnak hívják. Egy gél-lap egyik végére kicsi üregekbe töltik a molekulakeveréket, majd a gél két végére feszültségkülönbséget kapcsolnak. Mivel minden biológiai molekulának van töltése, ezért elkezdenek a megfelelő irányba vándorolni. A géleket alkotó molekulahálózatban a kis molekulák gyorsabban „futnak” és ezért messzebbre mozognak, a nagyobbak lemaradnak. Kicsit olyan, mintha egy galagonya-bozótosban vagy őserdőben rendeznénk futóversenyt, az apró termetű versenyzők kevesebb ágba akadnak be és gyorsabban haladnak, a termetesebbek lelassulnak és kevesebb távot tesznek meg ugyanannyi idő alatt.

A gélszűrésnél kicsit más a helyzet és a kimenetel. Itt egy gélgyöngyöket tartalmazó oszlop tetejére öntik  molekulakeveréket, majd átáramló oldószerrel elkezdik a gélen átmosni őket. A használt géleket alkotó molekulák térhálót alkotnak. A gél előállításainak körülménytől függően a térhálóban vannak különböző méretű üregek. Azok a molekulák akik kissebbek beleférnek egy-egy ilyen üregbe és megakadnak, a nagyobbak ezért gyorsabban haladnak előre. A végeredmény fordítottja lesz az előző módzserének, itt a nagy molekulák érnek át először és a kicsik lemaradnak. Ezt a módszer ti lehet gyerekekkel szemléltetni. Van egy gyerekcsapat, akikben vannak már nagyon jóllakot pocakosak, kicsit jóllakott, kicsit könyebbek, és éhes, vékony gyerekek. Engedjük be őket egy terembe aminek a másik végén knyelmes fotelekben remek filmeket lehet nézni. De! a terem hosszában helyezzünk el egy csomó asztalt, amire mondenféle finomságokat helyezünk el. Mi lesz az eredmény? A terem túlsó végére a legnagyobb, már jóllakott csimoták lrnek át először, aztán a részben jóllakottak, akik csak egy picit álltak meg csipegetni. Legvégül a legsoványabb, legéhesebbek érkeznek, mert ők sok asztalnál megálltak, hogy jóllakassák magukat. Az ismertetett technikákban az első módszert, az elektroforézist használják, hiszen az válogat térben, a másoik inkább időben, mikor mosódik le egy molekula.

A Southern blot Edwin Southern találmánya, és a DNS-szekvenciák felismerésére szolgál. A DNS-t olyan enzimekkel darabolják, melyek jellegzetes helyeken vágnak és az információtartalomra jellemző méretű darabokra szabdalják a DNS-t. A különböző méretű DNS darabokat gélen szétfuttatják, majd az innen membránra átmosott darabokat egy jelölt, komplementer DNS- vagy RNS-szakasz (probe) segítségével hibridizálják. Ez a próba csak ahhoz a DNS-régióhoz köt, amelynek a szekvenciája illeszkedik, így megmutatja, hogy a kérdéses gén vagy mutáció jelen van-e a mintában, és milyen méretű fragmentumban található. A Southern blotot ma főként genetikai állapotok megerősítésére vagy genomiális átrendeződések kimutatására használják.

És még egy blokk, a probe-okról. Watson és Crick óta mindenki tudja hogy a DNS kettős szálú. Ennek azért örültek annakidején annyira, mert egy másolódási mechanizmust is adott. Ugye a G kapcsolódik C-hez és a T az A-hoz. A két DNS szál egymást kiegészíti, komplementerek. No ezt használjuk a probe-okban is. Ha keresünk egy jellegzetes DNS szakaszt, mondjuk GATTACA (egy film címe is), akkor annak komplementere CTAATGT, helyett TGTAATC, mert a két szál iránya ellentétes, azaz meg kell fordítani. No ha csinálunk egy ilyen DNS szekvenciát és a végére biggyesztünk egy festékmolekulát vagy egy színes reakciót katalizáló enzimet, akkor probe-jainkkal, szondáinkkal meg tudjuk keresni és megjelölni a keresett DNS és RNS szekvenciákat. Ha fehérjékre vadászunk, akkor antitesteket kell használni és jelölni (bővebben itt).

A Northern blot ugyanilyen elven működik, de az mRNS-ek kimutatására szolgál. Neve szójáték, a Southern (déli) blot után ezt Northern (északi) blotnak nevezték. Itt a teljes RNS-mintát választják szét gélen, majd a membránra vitt RNS-eket egy jelölt, komplementer próba segítségével detektálják. Mivel a módszer a transzkriptumok méretét is megmutatja, alkalmas alternatív splicing vizsgálatára, génexpressziós különbségek kimutatására vagy arra, hogy egy adott gén mely fejlesztési vagy fiziológiai állapotban aktív. Bár ma az RNA-seq váltotta fel a legtöbb területen, a Northern blot továbbra is rendkívül megbízható és robusztus technika.

A Western blot (a fenti szójáték továbbvitele, nyugati, lehet tippeket adni mit hívhatnánk Eastern, azaz keleti blot-nak) a fehérjék analógiája: a fehérjéket SDS-PAGE segítségével méret szerint szétválasztják, majd membránra viszik, és a célfehérjét egy specifikus elsődleges antitesttel ismerik fel. A jel erősítésére egy másodlagos, enzimmel vagy fluoreszcens jelöléssel ellátott antitestet használnak, így a kívánt fehérje mennyisége és mérete jól láthatóvá válik. A Western blot a mai napig a fehérjekifejeződés és poszttranszlációs módosítások (az elkészült fehérje utólagos módosítása, pl. foszforiláció, gliko-proteinek) egyik legfontosabb vizsgálati módszere, mert nagy specificitást és viszonylag egyszerű kivitelezést biztosít.

Összefoglalva: mindhárom blot technika ugyanarra a logikára épül – szétválasztás, átvitel, célzott kimutatás –, de más-más molekulát céloz. A Southern a DNS-t, a Northern az RNS-t, a Western pedig a fehérjéket teszi láthatóvá, és mindhárom módszer fontos mérföldkő volt a modern molekuláris biológia kialakulásában. Az elsővel a mutációkat láthatjuk, a másodikkal, hogy egy adott szövetben, egy adott pillanatban milyen gének aktívak, azaz íródok át róluk mRNS, a harmadikkal pedig azt látjuk milyen és mennyi fehérje keletkezett, illetve, hogy ezek utólagos módosításra kerültek-e.

In situ hibridizáció: génkifejeződés térképezés

Itt a feladat az, hogy helyben mutassuk ki van-e ott valami. A fenti gyerekes példát használva, ha például azt szeretnénk tudni hol vannak egy réten mondjuk ürgelukak, akkor vegyünk egy nagy csapat gyereket, mindegyiknek adjunk egy lámpát és kérjük meg, hogy azt tegye le egy ürgeuk mellé. Ezután várjuk meg míg leszáll az est és egy drónról fényképezzük le milyen mintában vigítanak a lámpák a réten. Mi kellett ehhhez? Két dolog: egy feladat mit kell keresni és egy jelölés, a lámpa.

Az in situ hibridizáció olyan technika, amellyel meg lehet mutatni, képszerűen, mely sejtekben fordul elő egy (mutáns) DNS szakasz vagy kifejeződik egy adott gén mRNS-e, miközben a szövet térbeli szerkezete érintetlen marad. A módszer lényege, hogy a szövetszeletre vagy sejtmintára egy jelölt, komplementer DNS- vagy RNS-próbát visznek fel, amely csak ahhoz a DNS/mRNS-hez köt, amelynek a szekvenciája pontosan illeszkedik.

A kötődést különböző detektálási megoldások (radioaktív, fluoreszcens vagy enzimes jelölések) teszik láthatóvá, így kirajzolódik, mely sejtek aktívak a vizsgált gén szempontjából. A technika nagy előnye, hogy sejtszintű felbontással dolgozik, vagyis pontosan megmutatja, mely sejtek fejezik ki az adott gént egy bonyolult szövetben – ez különösen fontos az agy heterogén sejttípusainál. A módszer alkalmas fejlődési folyamatok, sejtvándorlási mintázatok és génexpressziós különbségek vizsgálatára is. Az in situ hibridizáció tehát egy olyan térképező eljárás, amely a génexpressziót nemcsak mennyiségileg, hanem térben és sejttípusok szerint is feltárja.

Egyenlőre még maradunk a klasszikusoknál. A következőkben a klasszikus genetikai beavatkozó módszereket tekintjük át.

Szerző: Gulyás Attila

Az előző bejegyzésben olyan molekuláris genetikai módszereket mutattunk be, melyek a sejtek és szövetek állapotának megvizsgálására voltak alkalmasak. Ha valamit megvizsgálunk, ismereteket szerzünk róla, összefüggéseket tárunk fel. De, mint azt már sokszor emlegettem, ha szigorúan tudományosak akarunk lenni, akkor meg kell különböztetni az összefüggést az okságtól. Azaz, nem elég azt látnunk, hogy A és B együtt fordul elő, azt is meg kell vizsgáljuk, hogy A okozza B-t, fordítva, közös okuk van, vagy véletlen az összefüggés. Ezt ugye úgy tehetjük meg, hogy egy kísérlet során megváltoztatunk valamit, és ennek következményeit vizsgáljuk, nem csak megfigyelünk. A mai bejegyzésben azt mutatom be hogyan működnek azok a célzott és kifinomult genetikai beavatkozó módszerek, amiket már lassan rutinszerűen használunk.

Cre-Lox és Flp-FRT rekombinációs rendszerek: Ide a rozsdás genetikai bökőt!

A fentiek olyan helyspecifikus rekombinációs technikák, amelyeket arra fejlesztettek ki, hogy a genetikai módosításokat csak meghatározott sejtekben vagy adott időpontban lehessen végrehajtani. Mindkét módszer egy rekombináz enzimre épül: a Cre a LoxP, a Flp pedig az FRT szekvenciákat ismeri fel, és ezek között végez kivágást, beillesztést vagy inverziót, a két szekvencia egymáshoz viszonyított orientációjától függően.

Már másodszor jönnek elő azok az enzimek amik a DNS-t egy meghatározott helyen, szekvenciánál vágják. Először ugye a Southern blottingnál, ahol a méret szerinti szétválasztáshoz a DNS-t először jellegzetes mintázatban fel kellett darabolni. Ezeket az enzimeket restrikciós enzimeknek és rekombináz enzimeknek hívják, és mindkettőnek természetes, biológiai eredete van.
A restrikciós enzimek baktériumokból származnak, és az eredeti feladatuk az, hogy megvédjék a baktériumot a vírusoktól. Ha egy baktériumot megtámad egy vírus, annak DNS-e bekerül a sejtbe, és a restrikciós enzim felismeri benne a „nem saját” DNS-szakaszokat, majd szétvágja a vírus DNS-ét, mielőtt az kárt okozhatna.    A restrikciós enzimek általában 4–8 bázispár hosszú, meghatározott DNS-szekvenciát ismernek fel. Nagyon gyakran ezek a szekvenciák palindromok, vagyis mindkét DNS-szálon „ugyanúgy olvashatók”.

Például EcoRI itt vág:
5’ – G | AATTC – 3’ (a vágás helyét a | karakter jelzi)
3’ – CTTAA | G – 5’ (a vágás 'ragadós' véget hoz létre, melyet könnyű összekapcsolni más DNS darabokkal)

Mivel egy 6 bázispár hosszú szekvencia átlagosan kb. 4⁶ ≈ 4000 bázisonként fordul elő, a genom jósolható méretű darabokra esik szét. A kutatók ezt a tulajdonságot használják ki a Southern blotban: a DNS-t pontos helyeken feldarabolják, hogy méret szerint szét lehessen választani.
A Cre enzim ezzel szemben egy rekombináz, amely eredetileg egy baktériumvírusból (bakteriofágból) származik. A természetben a feladata az, hogy a vírus saját DNS-ét átrendezze vagy kivágja a baktérium genetikai állományából, amikor a vírus életciklusa ezt megkívánja. A Cre pontosan felismeri a LoxP nevű DNS-szakaszokat, és csak ezek között hajt végre vágást és újraösszekapcsolást.

A Cre nem sok helyen, hanem nagyon ritkán előforduló -a mi esetünkben mesterségesen beépített szekvenciákat- ismer fel.
 LoxP szekvencia – 34 bázispár
 ATAACTTCGTATA | GCATACAT | TATACGAAGTTAT
Felépítése: 13 bp – felismerő rész, 8 bp – középső „irányjelző”, 13 bp – felismerő rész. A Cre nem egyszerűen feldarabolja a DNS-t, hanem kivágja a közte lévő szakaszt, vagy megfordítja, vagy áthelyezi, attól függően, hogyan állnak a LoxP helyek. A vágás a középső 8 bázispárnál történik, majd a DNS újra össze is kapcsolódik.

A kutatók ezt a „precíz ollót” használják fel arra, hogy élő szervezetekben szándékosan ki- vagy bekapcsoljanak géneket.

Összefoglalva: ezek az enzimek eredetileg mikrobák túlélését szolgálták, a kutatók pedig megtanulták őket „kölcsönvenni”, hogy a DNS-t ugyanilyen pontosan és megbízhatóan tudják vizsgálni vagy módosítani a laborban.

Ha a rekombinázt egy sejttípus-specifikus promóter irányítja, akkor a genetikai változás kizárólag abban a sejtcsoportban következik be, amely ezt a promótert kifejezi – így lehet célzottan módosítani például csak a gátló idegsejteket vagy csak a dopaminerg sejteket. A technika időben is szabályozható: a Cre-ERT2 és Flp-ERT2 változatok csak akkor lépnek működésbe, ha a kutató tamoxifent ad (lásd alant), így a rekombináció akár egy fejlődési szakaszban vagy egy kísérlet előtt indítható el.

A Cre-Lox klasszikusan a génkiütés (knockout) és génaktiváció (knock-in) eszköze, de bonyolultabb műveletekre is használható, például gének cseréjére vagy a fluoreszcens jelzések (reporterek) aktiválására különböző sejtcsoportokban. A Flp-FRT rendszer ugyanígy működik, de másik enzim–célhely párost alkalmaz, és gyakran használják kettős rekombinációs logikai kapuk kialakítására: például csak azok a sejtek aktiválódnak, amelyek egyszerre expresszálják a Cre-t és a Flp-et, vagy csak azok, amelyek egyik rekombinázt expresszálják, a másikat nem. Ez különösen akkor hasznos, ha egy bonyolult agyterületen belül szeretnénk nagyon finom alcsoportokat megcélozni.
A két rendszer stabil, öröklődő változásokat hoz létre, így transzgénikus egértörzsek százai épülnek rájuk, a modern idegtudomány egyik legfontosabb genetikai alapját képezve. Segítségükkel pontosan meghatározható, mely sejtek milyen szerepet játszanak egy viselkedésben, egy tanulási folyamatban vagy egy neurológiai betegség kialakulásában. 

DREADD technika: A piros vagy a kék tablettát választod?

A DREADD technika olyan módszer, amellyel a kutatók tartósan befolyásolni tudják idegsejtek működését. A DREADD-ek (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs) olyan genetikailag módosított receptorok, amelyeket a sejtek normál körülmények között nem használnak, és amelyeket a természetben elő nem forduló, hatóanyagok aktiválnak. Ez azt jelenti, hogy a kutató pontosan oda juttatja be a receptort – például vírusvektorral – ahol sejteket szeretne befolyásolni. Ezután egy tabletta, injekció vagy oldat formájában adható vegyülettel „kapcsolja be” vagy „kapcsolja ki” ezeket a sejteket. A DREADD-ek két fő típusa létezik: az egyik a másodlagos hírvivő rendszereket használva serkenti, a másik gátolja a célzott neuronokat. Ha serkentő DREADD-et fejeztetnek ki, az adott agyterület neuronjai aktívabbá válnak a hatóanyag beadásakor, így meg lehet vizsgálni, milyen viselkedést vagy élettani folyamatot indítanak el. Ha gátló DREADD-et használnak, akkor a sejtek „elcsendesednek”, és kiderül, milyen funkció esik ki vagy módosul ennek hatására. Ez különösen hasznos a bonyolult agyi hálózatok megértésében, mert megmutatja, mely sejtcsoportok felelnek egy adott viselkedési mintáért, emlékért vagy érzékelési folyamatért.

A módszer előnye, hogy nagyon célzott és kíméletes: az agyba csak egyszer kell bevinni a receptort, és ezt követően a sejtek működése akár hetekig vagy hónapokig szabályozható egy egyszerűen adható anyaggal. A DREADD aktiváló molekulák önmagukban hatástalanok az agy többi részére, így a manipuláció szinte mellékhatások nélküli. Emiatt a technikát széles körben használják olyan kérdések vizsgálatában, mint például hogy mely idegsejtek szabályozzák a szorongást, hogyan működnek a memóriahálózatok, vagy milyen sejtek tartják fenn a napi ritmust. A DREADD tehát egy olyan finom „távirányító” az idegsejtek felett, amellyel a kutatók biztonságosan, visszafordíthatóan és nagyon pontosan tudják manipulálni az agy működését.

Tet-On/Tet-Off rendszerek: Ezt vedd be, ettől máshogy leszel!

A Tet-On/Tet-Off rendszerek olyan kapcsolható génexpressziós technikák, amelyek lehetővé teszik, hogy egy tetszőleges gént időben szabályozhatóan kapcsoljunk be vagy ki sejtekben vagy élő állatokban. A módszer alapja egy módosított bakteriális szabályozófehérje (tTA vagy rtTA) és egy hozzá tartozó mesterséges promoter (tetO/TRE). A Tet-Off rendszerben a tTA fehérje normál esetben aktiválja a gént, de ha a kutató tetraciklint vagy doxiciklint ad, akkor a fehérje elveszíti kötőképességét, és a gén kikapcsol. A Tet-On rendszer ennek fordítottja: a gén csak akkor kapcsol be, ha jelen van a doxiciklin, mert a módosított rtTA fehérje csak ekkor képes a promoterhez kötni.

A rendszer nagy előnye, hogy a gének expressziója tetszőleges időpontban vezérelhető, ami kritikus például fejlődési folyamatok, agyi átrendeződések vagy viselkedési kísérletek vizsgálatánál. Megnézhetjük például, hogy egy adott géntermék mikor és milyen szerepet játszik az embrionális fejlődésben. Emellett dózisfüggő: minél több doxiciklin kerül a szervezetbe, annál erősebb a gén aktivációja, így finoman hangolható a kifejeződés mértéke. A technika jól kombinálható sejttípus-specifikus promóterekkel és vírusvektorokkal, így a vizsgálat céljától függően akár csak egyetlen sejttípusban, például gátló interneuronokban vagy dopaminerg sejtekben kapcsolható be egy transzgén.

Transzgénikus Tet-On/Tet-Off egérvonalak széles skálája létezik, melyekkel például riportergének, opszinok vagy patológiás fehérjék időzített expressziója tanulmányozható. A módszer különösen nagy értéke, hogy reverzibilis: ha a kutató abbahagyja a doxiciklin adagolását, a gén kifejeződése leáll, így ugyanazon állaton belül vizsgálható egy gén funkciójának megjelenése és eltűnése. Összességében a Tet-On/Tet-Off rendszerek a modern idegtudomány egyik legfontosabb genetikai „kapcsolótábláját” jelentik, amelyekkel pontosan és megbízhatóan szabályozható a gének működése.

A következő passzusokban az újkeletű technikákat bemutató korábbi ámokfutást lassú szemlélődő sétával heverjük ki.

Szerző: Gulyás Attila

És akkor most lassú nyugalmas tempóban vágjunk bele az utóbbi években kidolgozott mérési és kísérleti módszerekbe. Megnézzük részleteikben hogyan működnek és mire használhatók.

Multiplex immunhisztokémia

Ez szigorúan véve nem genetikai technika, hiszen nukleinsav manipulációt nem alkalmaz. De, mint jelentős, 2025ben új módszert, itt érdemes bemutatni. A többszörös fluoreszens immunfestés extrém felturbózott alakja, alapelvei is hasonlóak.
Nem egyetlen fehérjét, hanem 5–20 (új technikáknál akár több tucat) molekula elhelyezkedését vizsgáljuk ugyanazon a szövetszelvényen. 

Két fő stratégia létezik: (1) Spektrális multiplexelés - Minden ellenanyag különböző színű festéket (fluorofórt) kap. A mikroszkóp spektrális felbontással külön választja a jeleket. (2) Ciklikus eljárások - Egy körben 2–4 marker festése → kép készítése, majd fluorofór inaktiválása/elvonása. Újabb 2–4 marker festése → kép készítése. Végül a képeket algoritmus rendezi egyetlen multiplex képpé.
A módszer különösen hasznos az agykutatásban, mert megmutatja, hogyan helyezkednek el egymáshoz képest a különböző neuronok, gliasejtek vagy szinaptikus fehérjék, illetve hogyan változik a sejtek összetétele betegségekben. A multiplex immunhisztokémia tehát egy olyan „többrétegű szövettérkép”, amely egyszerre mutatja meg a szövet szerkezetét és molekuláris sokszínűségét.

Spatial transcriptomics: Hogyan lesz térkép a a gének kifejeződéséből.

A spatial (térbeli) transcriptomics lényege, hogy nemcsak azt tudjuk meg, milyen gének aktívak egy szövetben (milyen mRNS-eket találunk), hanem azt is, hogy hol aktívak. Ez azért forradalmi, mert a rétegekből, magokból és területekből álló agyban a génexpresszió sejtekre és rétegkre jellemző mintázatai sokszor csak térbeli elhelyezkedésüket figyelembe véve érthetők meg igazán. Megint előrángatva a szociológusokat. Annál az adatnál, hogy milyen a fizetések és az iskolai végzettségek eloszlása, sokkal többet mond, ha felrajzoljuk, hogy a különböző végzettségű és keresetű emberek, hol laknak Budapesten. Ebből például már megtudhatjuk, mely városrészekben milyen típusú feladatokat kell megoldani.

Ehhez nem elég tudni azt, hogy egy agyterületen ilyen és ilyen molekulák találhatók a sejtekben, hanem azt is kell látni, hogy a terület mely részének (mag, réteg), mely sejtjeiben, milyen molekulák fejeződnek ki együtt. A technika trükkje egyszerű elv köré épül. Minden mRNS-t „megjelölünk” a keletkezési helye alapján, majd ez a jelölés végig „rajta marad” a feldolgozás során.

1. Lépés: Az agyszövetet gyorsan lefagyasztják (hogy az mRNS-eket megőrizzék), majd 5–10 µm vastag szeleteket vágnak. Ezeket ráhelyezik egy speciális tárgylemezre, amelyre korábban apró, láthatatlan RNS pozíciókód szekvenciákat nyomtattak („boltban” lehet ilyen lemezeket vásárolni). Ezek a mikroszkopikus kódmezők a térbeli információ kulcsa.

2. Lépés: A tárgylemez felülete mikroszkopikus rács, amelynek minden pontja tartalmaz egy egyedi térbeli vonalkód szekvenciát (barcode) és egy hozzá kapcsolt oligo(dT) szakaszt. Ez köti majd meg az mRNSek poli-A farkát. Ez a rács valójában több ezer minilabor, minden egyes pont egyedi azonosítót hordoz. Mintha a szövetet egy olyan papírra tennénk, amely négyzetrácsos, és minden négyzet más-más QR-kódot tartalmaz.

3. Lépés: Az mRNS-ek „ráfolynak” a kódokra. A szövetet fixálják és átjárhatóvá teszik. Ez azt jelenti: a sejtek kinyílnak, az mRNS-ek kiszabadulnak, és belefolynak a tárgylemez alatti mikropontokba. A kiszabadult mRNS-ek ott kötődnek meg, ahol épp „leszálltak” – vagyis azon a pixelhelyen, amely alatt a sejt volt. Ezzel a térbeli információ át is adódott, minden mRNS megkapja annak a pixelnek a vonalkódját, amely alatt volt.

4. Lépés: Az mRNS-ekről cDNS készül, amelybe beépül a térbeli vonalkód is, tehát a cDNS két információt tartalmaz: MELYIK génhez tartozik (szekvenciából tudjuk) és hogy HONNAN származik a szövetben (barcode alapján). Ez a kettős jelölés teszi lehetővé a térképezést.

Itt egy kis magyarázó kitérő. Mi az a cDNS és a reverse transcription? A biológiai rendszerek legtöbbjében (kivéve néhány vírust) a genetikai információt az RNS-nél ellenállóbb DNS hordozza. Erről íródnak át aztán a különböző RNS-ek, melyek vagy a fehérjeszintézishez szállítanak információt vagy pl. riboszóma alkatrészek lesznek. Ezért ugye a sejtekben a DNS replikálódik, az RNS nem. Tehát a sejtek enzimrendszere, amit mi is használunk a molekuláris biológiában, alapjában véve DNS manipulációra van „fejlesztve”. Ezért amikor RNS-információval szeretnénk dolgozni, annak információ tartalmát először átmásoljuk DNS-be, majd azzal dolgozunk. Az RNS -> DNS információ áramlási irány nem szokványos a biológiában, de néhány retrovírus rendelkezik olyan enzimekkel, amik ezt a másolást meg tudják csinálni, ez a reverse transcriptáz. A retrovírusok pontosan erről az akcióról kapták a nevüket. Alapjában véve RNS-t használó vírusok, de szaporodásukhoz először DNS-be másolják kódjukat, sőt ez beépül a genomba is, ahonnan évek múlva is újra előbújhatnak (ilyen az AIDS vírus is).

5. Lépés: A cDNS-ek összegyűjtése és szekvenálása (bázissorendjének, azaz információtartalmának meghatározása). A térbeli kódolt cDNS-eket leválasztják a tárgylemezről, majd nagymélységű szekvenálást végeznek (RNA-seq). 
Az eredmény egy hatalmas lista:

Ez lényegében egy számítógépes puzzle, de minden darab (mRNS) megmondja, melyik négyzetből származik.

6. Lépés: Térképpé alakítás. A bioinformatika rekonstruálja a rács szerkezetét, melyik pixelben milyen mértékben fejeződött ki adott gén, hogyan különülnek el a sejttípusok térben, mely gének aktívak együtt egy-egy rétegben, magban, agyterületen. Az eredmény egy olyan hőtérkép, amely megmutatja, hol milyen gének „világítanak” a szövetben. Ez vizuálisan nagyon hasonlít az agyi aktivitást mutató fMRI térképekre – de itt nem véráramot, hanem konkrét gének működését látjuk. Ábrázolhatunk színekkel egyszerre több gént, de akár arányokat, összefüggéseket is megjeleníthetünk.
7. Lépés: Sejttípusok és anatómiai rétegek rekonstruálása.
Mivel egy pixelbe több sejt is eshet, a modern algoritmusok mért génkombinációk alapján sejttípusokat következtetnek és térbeli csoportosítást végeznek, a térkép rétegeit és határait automatikusan felismerik. Az eredményeket integrálják más adatbázisokkal (Allen Brain Atlas, Cell Types Database). Így megkapjuk mely rétegekben vannak pl. GABAerg sejtek, hol vannak serkentő projekciós neuronok, melyek a gliasejtek gyűjtőzónái, hogyan változik mindez betegség, fejlődés vagy stressz hatására.

Röviden összefoglalva
A spatial transcriptomics kulcsa, hogy a szövetet egy kódolt rácsra helyezzük. Minden rácspont egyedi vonalkódot tartalmaz. A sejtekből „kiszabaduló” mRNS-ek megkapják ezt a kódot. A kód beépül a cDNS-be. A szekvenálás után minden molekuláról tudjuk, hogy melyik helyen volt. A génkifejeződés így térképpé válik.
Ez a módszer egyfajta molekuláris GPS az agyszövetben, megmutatja, hol vannak az egyes sejttípusok, milyen génhálózatok aktívak, és hogyan szerveződnek térben.

Nyilván ezt még lehet azzal barokkozni, hogy mondjuk az embrionális fejlődés során egyre későbbi időpontokban végezzük el ezt a térképezést, vagy például összehasonlítunk egy egészséges és egy beteg agyat. Így felderíthetjük a fejlődést mozgató térbeli kölcsönhatásokat vagy hogy egy-egy betegség mely sejtek változásából ered.

Szerző: Gulyás Attila

Emlékeztek még arra, a hőskorban hogyan néztük meg mely agyterület van összeköttetésben egy másikkal? Nyomkövető anyagokat, vagy kicsit később vírusokat adtunk be egy-egy agyterületre, majd immunfestéssel kimutattuk, hogy egyes sejtek hova küldik axonjaikat. Ezekkel a módszerekkel egyedi kísérletekkel lehetett felderíteni, hogy egy terület hova vetít (anterográd jelölés), vagy mely területek vetítenek egy helyre (retrográd jelölés). Az agyban azonban sok terület van, és a kombinatorikus robbanás miatt ezeket rengeteg lehetséges pálya kötheti össze. Arról nem is beszélve, hogy tapasztalatink szerint, egy agyterület különböző sejtcsoportjai más célterületre vetíthetnek. Szükség volt tehát olyan módszerekre, melyek egy menetben rengeteg vetítést derítenek fel, és még a kiinduló sejtek típusát is meghatározzák.

A bemutatandó két módszer kidolgozása erre az igényre adott megoldást. Mindkettő DNS-alapú módszer, amelyekkel axonpályákat lehet nagy felbontással követni, sok sejtre egyszerre. 
MAPseq (Multiplexed Analysis of Projections by sequencing): Vírusvektorral egyedi nukleinsav-barkódot (vonalkódot) juttatnak be sok idegsejtbe. Ennek hatására egyes idegsejtek axonágai ugyanazt a vonalkódot fejezik ki, mely megjeenik a célterületeken. A célterületek szövetmintáit felszeletelik, és szekvenálják az ott megjelenő vonalkódokat. Ha egy vonalkód X agyterületen jelenik meg, akkor a hozzá tartozó neuron oda vetít. Eredmény: több ezres projekciós mintázat egyetlen kísérletben.
BARseq (Barcoded Anatomy Resolved by sequencing): Fejlettebb változat, mely ugyanúgy vonalkódolt vírusokat ad be, de ezután térben lokalizálható in situ szekvenálást használ. Ez lehetővé teszi, hogy: megőrizzük a sejtek anatómiai helyét, és mégis több ezer kapcsolatot deríthessünk fel, így a teljes agy projekciós architektúrájának hatékony feltérképezésére alkalmas. Új sejttípusok – különösen vetítő neuronok – osztályozására, hálózati modellek ellenőrzésére (pl. PFC–talamusz–striátum kör finomszerkezetének felderítésére) használható.

A dolgok menete:
1. A kutatók előre elkészítenek egy vírusbankot (library-t), mely sok-sok (tízezres–százezres) különböző, véletlen nukleinsav-szekvenciát tartalmazó vírusrészecske-keveréke. Mindegyik barcode egy rövid (~30–100 bázis) random DNS-sor, így minden vírusrészecske egyedi kódot hordoz.
2. A víruskeveréket (AAV- vagy lentivírus) injekcióban egy adott agyterületre adják be (pl. V1, piriform cortex, hippokampusz CA1 stb.). A terület nagyságától és sejtszámától függően lehetőség szerint úgy hígítják a vírust, hogy egy sejtet átlagosan csak 1 virion fertőzzön meg. 
3. A vírus bejut a neuronba, és kifejezi a barcode RNS-t. Ez az axonba is eljut, így a célterületeken lévő axonterminálisokban is kimutatható lesz a kód. Ezért tudják szekvenálni a célterületből az axonvetítések mintázatát. BARseq-ben a barcode DNS vagy RNS in situ kerül szekvenálásra, ezért térinformatikailag is megmarad a sejt és a vetítés helye és identitása.


Számos kérdésre kaphatunk így választ:
1. Vajon ugyanabból az agyterületből a különböző sejtek eltérő célterületekre vetítenek-e? Példák: V1 vizuális kéreg rétegeinek sejtjei -> külön projekciós „típusok” (superior colliculus, lateralis geniculatus, másodlagos kéregmezők)
Piriform kéreg  -> szétszórt, diffúz projekciók egyedi mintázatokkal
Prefrontális kéreg  -> striatum és talamusz alterületeinek összeköttetése

2. Elágaznak-e a sejtek axonjai?
Ha egy sejt axonja több célterületre is vetít, akkor ugyanaz a molekuláris kód jelenik meg több különböző szöveti mintában. Ennek feltérképezése korábban rendkívül nehéz volt, mert hagyományos nyomkövető anyagokkal vagy teljesen töltötted a sejtet (de akkor egyetlen sejtről volt adat), vagy tömeges jelölést alapján kellett sejt-populációk vetítését átlagolni. 

3. Mekkora az átfedés az egyes sejtek vetítése között?
A MAPseq/BARseq adatstruktúra természeténél fogva minden neuron egy vektor, amelynek dimenziói a célterületek, a vektor komponensei a barcode-felbukkanások aránya az adott területeken. Ez alapján mérhető két sejt mennyire vetít ugyanoda, mennyire különböznek a mintázatok, vannak-e jól elkülönült alcsoportok, gradiensek vagy folyamatos átmenetek? Az egyik nagy felismerés az volt, hogy sok agyterület nem homogén projekciós egység, hanem belül több sejtcsoport finoman eltérő vetítő mintázatot mutat. Ezt a hagyományos anatómia nem látta.

4. Sejttípusok összeköthetők projekciómintázatokkal. A BARseq in situ olvasása miatt, a sejt anatómiai helye, molekuláris profilja és projekciós mintázata összekapcsolható. Tehát megmondható például, hogy a felső V1 (elsődleges látókéreg) rétegek mely neuronjai vetítenek a superior colliculusba, és melyek a talamuszba, hogy piriform cortexben milyen molekuláris alcsoport milyen projekciós mintázattal jár, hogy a prefrontális kéreg mely alcsoportjai vetítenek a dorsalis vs. ventralis striatumba. Ez funkcionális-anatómiai „sejttípus × hálózat” mátrixot ad.

5. A teljes agyon belül térképezhető egyetlen axon jelenléte. MAPseq esetében bármely agyterület, amelybe az injektált populáció vetít, „felvillan”. Akár távoli vagy nagyon gyenge projekciókat is megtalál. Ez sokszor olyan célterületeket is kimutat, amelyeket klasszikus pályakövető technikák nem láttak vagy vitatottak voltak a gyenge jel miatt.

6. Nagyszámú sejt vetítésének vizsgálata statisztikai alapú hálózati elemzést tesz lehetővé. Projekciós csoportokat, funkcionális modulokat, hálózati hierarchiákat (pl. PFC -> talamusz -> striatum rendszer) lehet precízen feltérképezni. Ez alapvető változást hozott a „connectomics” területére, mert sejtszinten, nem csupán rostkötegekkel dolgozik. Radásul a tömeges connectome eredményeket nyújtó DTI-MRI-vel ellentétben a vetítések irányáról is beszámol.

A MAPseq és BARseq segítségével tehát meg lehet mondani:
✔ hogy egy régió különböző neuronjai hova vetítenek
✔ hogy egy axon elágazik-e és hány célterülete van
✔ hogy mennyire fedik át egymást a neuronok projekciós célpontjai
✔ hogy a projekciók erőssége milyen mintázatot követ
✔ hogy a projekciók összekapcsolhatók-e molekuláris sejttípusokkal
✔ hogy teljes agyon belül „hol bukkan fel” egy adott neuron axonja
Tehát a módszerek nem csak azt mondják meg, hova megy egy axon, hanem a projekciós logika mögötti sejttípus- és hálózatszerveződést is feltárják.

A következőkben a hasonlóan nagy áteresztőképességű „omics” technikákkal folytatjuk.

Szerző: Gulyás Attila

Az „omics” gyűjtőfogalom olyan módszerekre, amelyek egyszerre több ezer komponenst mérnek. Nagy áteresztőképességű molekuláris térképezés, mely előbb üt, aztán kérdez. Azaz rengeteg adatot gyűjt be, majd utána big-data elemzésekkel feltárja az összefüggéseket. 

Miért fontosak az omics technikák az idegtudományban?
A klasszikus módszerekkel csak egy-egy génre vagy fehérjére tudtunk fókuszálni.
Az agy azonban nem így működik: rendszerek, hálózatok, sejtprogramok állnak össze a viselkedés mögött. A modern omics és multiomics technikák lehetővé teszik, hogy:
egyetlen sejtről több száz vagy ezer adatot kapjunk, az anatómiai helyzettel összevethető molekuláris térképeket készítsünk, a környezeti hatások (stressz, drogok, traumák, tanulás) okozta változásokat, szabályozómechanizmusok szintjén értsük meg. 

Bulk és egysejt-transzkriptomika (scRNA-seq)
Ennek a tébeli felbontása ez előzőnél finomabb. A technikával egyedi sejtek génexpressziós mintázatát tudjuk meghatározni. Nincs többé „átlagos molekuláris jel” egy agyterületből, helyette minden sejt külön molekuláris ujjlenyomatot kap. Különböző neuron- és gliasejttípusokat azonosíthatunk, megtudjuk fejlődési vonalaikat, érési folyamataikat. Megnézhetjük, hogy a tanulás, stressz, drogok hogyan módosítják az egyedi sejttípusok génaktivációját. Kereshetünk kóros sejttípusokat pl. epilepsziában, neurodegenerációban. A scRNA-seq lett az elmúlt 10 év legfontosabb sejtbiológiai technikája. A módszert bemutató YouTube videó (angolul).

ATAC-seq – A kromatin nyitottságának mérése
Az ATAC-seq azt mutatja meg, mennyire hozzáférhető a DNS a szabályozó fehérjék számára. Ez a génaktiváció alapja, ugyanis a génátíráshoz a DNS bizonyos szakaszainak ki kell tekerednie (nyitott kromatin). A zárt, csomagolt régiók nem olvashatók – ezek inaktívak. Az ATAC-seq tehát egyfajta epigenetikai feltérképezés, ami megmutatja: mely gének potenciálisan bekapcsolhatók, hol vannak enhancer vagy promoter régiók aktív állapotban, hogyan változik a kromatin stressz, tanulás vagy drogok hatására.

scRNA-seq + ATAC-seq kombinációja: Génexpresszió és epigenetika egyszerre
Ez az irány gyakran „multiomics single-cell profiling” néven fut.
A scRNA-seq (single cell, egysejt szekvenálás) megmondja milyen gének aktívak egy sejtben, az ATAC-seq pedig hozzáteszi miért aktívak (milyen epigenetikai állapot teszi lehetővé). Így a génexpressziós változások okai is vizsgálhatók, a környezeti hatások (stressz, droghasználat, tanulás) által kiváltott változások molekuláris mechanizmusa feltárható, a sejtállapotok precízen kategorizálhatók. Ez a módszer jelenleg a legmélyebb betekintést adja a komplex idegrendszeri adaptációkba.

Proteomika – az összes fehérje mérése
Az ATAC-seq azt mutatja meg a genom mely része írható át, a transzkriptom azt mutatja, milyen mRNS van jelen (azaz valóban mi jródhat át ), a proteomika azt, hogy ebből milyen fehérje keletkezik ténylegesen. Mivel az mRNS-ek átirásának is vannak szabályozó rendszerei, ezért fontos tudni mely mRNSkből lesz az adott állapotban fehérje, az igazi végrehajtó molekula. A kettő között gyakran nagy a különbség, ezért fontosak a proteomikai mérések. A mérések során a mintát először tripszinnel megemésztik aminek hatására a fehérjék jellegzetes polipetid darabokra esnek szét. Minden fehérjére jellemző egy polipeptid mintázat. Ezeket a darabokat két lépcsős tömeg spektrometriával elezik, melynek során a peptideket súlyuk és elektromos töltésük arányának nagyon finom eltérései alapján azonosítják. Utána adatbázis feldolgozó módszerekkel azonosítják, hogy a peptid darab eloszlás alapján milyen eredeti fehérjék azonosíthatók.
Modern irányok: térbeli proteomika – hol vannak a fehérjék a szövetben, időbeli proteomika – hogyan változnak gyors folyamatok alatt.

Lipidomika – a sejt zsírkomponenseinek mérése
A lipidek (zsírok) nem csak energiatárolók, hanem:
•    sejthártya építőkövei,
•    jelátviteli molekulák,
•    neuromodulátorok,
•    gyulladásos válaszok kulcselemei.
A lipidomika az agyban különösen fontos, mert a membránok összetétele szabályozza a receptorok működését, az axonok szigetelésében fontos mielinhüvely zsírokban gazdag, neurodegenerációban a lipidanyagcsere zavara korai jel. A legújabb módszerek már térben is képesek lipidfajtákat lokalizálni, azaz nem csak azt mondják meg, hogy egyfajta zsír előfordul, hanem azt is hol.

Ezekkel a módszerekkel az idegtudomány egy új korszakba lépett. Az agy működését már nem csak elektromosan vagy anatómiailag, hanem molekuláris hálózatokként is tudjuk vizsgálni.

Szerző: Gulyás Attila

Az idegrendszeri betegségek nagy része nem egyetlen hibás gén miatt alakul ki, hanem sok száz vagy ezer, önmagában betegséget nem okozó apró genetikai variáns szerencsétlen kombinációja miatt. Ezért hívjuk őket poligénes (sokgénes) betegségeknek. Ide tartozik például: skizofrénia, major depresszió, bipoláris zavar, autizmus spektrum zavar, ADHD, Alzheimer-kór korai rizikóvariánsai, szorongásos zavarok és az addikciók genetikai hajlama.

A poligénes betegségeket okozó gének keresésénél a gond az, hogy a génvariánsok nagyon kis egyedi hatással bírnak, csak kombinációban okoznak betegséget. Évtizedekig nem lehetett megmondani, hogy a hibás gének hogyan és mely sejttípusokban fejtik ki hatásukat, mely agyterületekben érvényesülnek és milyen biológiai mechanizmuson keresztül vezetnek betegséghez.

Az utóbbi időben, a korábban bemutatott nagy áteresztőképességű módszereknek és a keletkezett adatok hatalmas adatbázisokba rendezésének és közzétételének eredményeként, a genomika adatmennyisége robbanásszerűen nőtt. A hatalmas emberi genetikai adatbázisok (UK Biobank, All of Us, FinnGen, biobankok Ázsiában, stb.) jelenleg milliós populációk adatait tartalmazzák: egészgenom-szintű variánsok, diagnózisok, életmódfaktorok, képalkotó adatok, transzkriptomikai és epigenetikai kiegészítő információk. A megfelelő statisztikai módszerekkel (GWAS, fine-mapping, polygenic risk score, gene regulatory mapping, causal inference, LD-score regression, eQTL-analízis stb.), a hatalmas adathalmaz feldolgozásával nagyon ritka betegségeket és nagyon ritka gén-kombinációkat is megtalálhatunk. Már nemcsak azt tudjuk meg, melyik gén vagy terület érintett, hanem azt is, hogy mely sejttípusokban aktívak ezek a gének, milyen jelátviteli vagy fejlődési útvonalak módosulnak, és mely agyterületek különösen érzékenyek.

Kiderült, hogy a poligénes rizikó nem egyformán hat minden idegsejtre, bizonyos neurontípusok sokkal érzékenyebbek genetikai variánsokra, az idegrendszer fejlődése alatt fellépő kockázatok sejtspecifikusak, illetve, különböző betegségekben más-más sejttípusok dominálják a rizikót. Sok poligénes variáns nem a sejtek kisülésére hat, hanem a sejtekre érkező szinaptikus jelek összegzésére. A rizikóvariánsok aránytalanul gyakran változtatják meg a gátlósejtek, különösen a somatostatin tartalmú (SOM) sejtek génhálózatait. 

Ezt a képet azért kicsit finomítanám. Valószínűleg nem csak a gátlósejtek génmódosulatai fontosak a helyes/hibás agyműködés kialakulásában, hanem a serkentő sejtekéi is. De, míg a serkentő sejtek az alapvető jelfeldolgozást végzik (reprezentáció, komputáció, tanulás, lásd itt), addig a gátlósejtek a rendszer finomhangolásában és működési módjai közötti átkapcsolásan fontosak. Ezek miatt, ha a serkentő sejtek kialakításában fontos gének mutálnak, akkor nem „finom” hibákat, hanem durva, halálos, embrionálisan spontán vetéléshez vezető elváltozásokat kapunk (epilepszia, elakadt agyfejlődés), melyet nincs alkalmunk később alaposabban vizsgálgatni. És hát bármily szomorú is, lássuk be, hogy a fenti komoly betegségek (skizofrénia…) esetében az agy 98%-ban jól működik, tudunk tanulni, emlékezni, gondolkodni, csak egy kicsit másképp. Valószínűleg ez a kicsit másképp a rosszul hangolt gátlósejtek miatt van, akik miatt a jelfeldolgozás finomságai nem pontosan úgy történnek, ahogy az normális.

Ezeket a sejteket vizsgálták meg Duncan és munkatársai 2025-ös Nature Neuroscience cikkükben. Mivel ezek a gátlósejtek a serkentősejtek dendritjére adnak gátlást, kulcsfontosságúak a serkentősejtek jelintegrációjának finomhangolásában, szerepük van a ritmusgenerálásban (theta, gamma) és viselkedés szinten meghatározzák, hogyan épülnek be az agy működésébe a környezetből érkező információk. A poligénes variánsok gyakran szabályozó, nem pedig kódoló DNS szakaszokon vannak. Mivel fejlődési génhálózataik érzékenyek a transzkripciós szabályozás apró módosulásaira, a SOM interneuronok erősen bevonódnak a skizofréniához kapcsolt transzkripciós hálózatokba, affektív zavarok rizikóútvonalaiba, stressz-adaptációba és az agykérgi plaszticitás modulációjába.
A transzkriptomikai térképek (pl. Allen Brain Atlas, 10x Visium datasetek) szerint a poligénes rizikóvariánsok célpontjai térben tömörülnek, elsősorban éppen ott, ahol a SOM-sejtek előfordulnak.

A poligénes eredmények tehát nem géneket néznek külön-külön, hanem a teljes rizikóvariáns-készletet vetítik sejttípusokra, agyi rétegekre, fejlődési időablakokra. Az eredmények feloldják a „gén -> funkció” kérdést.

Az egy gén-egy funkció képet mindig végtelenül egyszerűnek tartottam. Az evolúció nem mérnök, egy felmerülő feladatot nem egy újabb kütyüvel fog megoldani. Abból dolgozik, ami van, azokat tesz egymás mellé, ami együtt tud valamit csinálni. Egy gén számos funkció megvalósításában játszhat szerepet és egy funkcióhoz számtalan génre van szükség. Szemel láthatólag a poligénes elemzések végre alkalmasak lesznek ennek az összetett kölcsönhatás és szemlélet láncolatnak a megalapozására. Persze ne csodálkozzunk a kezdeti, naiv hozzáálláson, hiszen amikor csak egy gént és egy funkciót lehetett csak mérni egyszerűbb volt az egy gén/egy sejttípus – egy funkció keretek között gondolkodni.

A feltárt mechanizmus most így néz ki:

Rizikóvariáns -> a szabályozó rendszer módosul -> SOM-sejt génhálózata megváltozik -> dendritikus jelintegráció károsodik -> kognitív működés / viselkedés eltolódik
Ez sokkal érthetőbb oksági térképet ad, mint a korábbi statisztikai asszociációk.

Szerző: Gulyás Attila

Mik azok az organoidok és mire jók? Nevük organ-oid, magyarul szerv-szerű, azt jelenti, hogy olyan tenyésztett, összetett szövetképződmények, melyek igazi szervekre hasonlító felépítést mutatnak. 

Rángassuk elő a szerveződési szinteket. Onnan, hogy sejt, szövet, szerv, szervrendszer. Ugye hasonló szerkezetű és működésű sejtek meghatározott funkciójú szövetet alkotnak (izomszövet, hámszövet, kötőszövet), több szövet szervet alkot, mivel egy szerv működéséhez eltérő tulajdonságú szövetekre van szükség (pl. a szív izomszövetből, hámszövetből, idegszövetből áll). A szervek szervrendszerekké állnak össze (pl. vérkeringés a szívből, az artériákból, a vénákból és a vérképző szervekből áll). Mindezek alapján az organoid különböző, megfelelő módon egymáshoz kapcsolódó sejttípusokból, szövetekből épül fel.

Különböző sejttípusokat már lassan egy évszázada tenyésztenek egyedül vagy más sejttípusokkal együtt, hogy működésüket és gyógyszerek hatását vizsgálják. Összeszámolhatatlanul sok eredmény született használatukkal. De a magukban tenyésztett sejtek nem teljesen úgy viselkednek és fejlődnek, mintha egy szövet részei lennének, mert hiányoznak a környezetükből a más sejttípusoktól eredő mechanikai és kémiai jelek, melyek helyes fejlődésüket irányítanák. Hogy számos összetett biológiai problémát megtámadhassunk szükség volt egy, az élő rendszerekhez jobban hasonlító kísérleti modellrendszerre. Mik ezek a kérdések:
A biológia egyik legizgalmasabb területe a fejlődésbiológia, vagyis annak megértése, hogyan alakul egy élőlény a zigótától, az embrión át a felnőtt állapotig. Egyes szervezeteknél – például a zebradániónál (a fejlődésbiológusok egyik modellállatánál) – ez könnyen megfigyelhető mikroszkóp alatt, hiszen a milliméteres átlátszó halembrió erre remek objektum. Másoknál, mint az ember, a fejlődés rejtve zajlik. Bár emberi sejtekkel dolgozni nem új keletű dolog (gondoljunk a HeLa-sejtekre ), az organoidok valódi újdonsága abban rejlik, hogy emberi szövetek háromdimenziós, hosszú távon fenntartható modelljeit adják. A 3D növekedés lehetővé teszi, hogy a sejtek hasonló módon szerveződjenek, mint a testben. Ez különösen fontos, mert – bármennyire hasznosak is – az egerek nem emberek, és sok betegség nem modellezhető jól állatokban.
És itt jön a második terület, ahol az organoidok hasznosak: a betegségek és a gyógyszerek. Számos gyógyszer a szabadon álló sejteken hat, de pl. egy összetett szövetben, az érfalak és más szövetek miatt, nem képes eljutni a célterületre, vagy míg bizonyos sejtekre hatásosan hat, más sejttípusokat károsít. Az organoidok tehát alkalmasak lehetne gyógyszerek hatékonysgának és veszélyeinek tesztelésére és ezáltal állatkísérleteket válthatnak ki.

Organoidokat az egyénre szabott orvoslásban is ígéretesen lehet használni. Mutációk okozta betegségek kezelési stratégiáit lehet kidolgozni a betegből származó szövetmintából előállított organoidokon, melyek hordozzák a kezelendő személy egyéni variációit. Különösen hasznosak lehetnek daganatterápiában. A daganatos sejtek ugyanis egyedi mutációk következtében kezdenek el fékevesztetten osztódni. A megfelelő kemoterápia megtalálásához tudni kell a kialakult rák mögött milyen mutációk állnak, megválasztani a kezelésre használt megfelelő citosztatikumot vagy citosztatikum keveréket. Hatékonyabb, biztonságosabb és főleg olcsóbb, ha előbb a daganatos sejtekből növesztett organoidokon tesztelik a különböző keverékeket és csak miután hatékonynak bizonyultak vetik azt be a betegen. A citosztatikumok jelentős része hihetetlenül ritka molekula, előállítások nagyon drága. Ha organoidon tesztelünk, akkor több nagyságrenddel kevesebb anyagot kell használni, mint ha egy emberen próbálkoznánk. Nem beszélve egy rosszul választott citosztatikum veszélyeiről.

Van egy intim összefüggés az embrionális fejlődés, a regeneráció, a rák és az organoidok között. Az embrió egy megtermékenyített petesejtből, a zigótából fejlődik. Ő az igazi őssejt, hiszen egy egész egyed őse lesz. Totipotens (mindenre-képes), képes arra, hogy osztódjon és eltérő tulajdonságú szöveteket létrehozó sejtekre differenciálódjon. Ehhez az kell, hogy genetikai szabályozó hálózata alapállapotból induljon és fejlődés közben a keletkező leánysejtekben a genetikai szabályozó hálózat egyedi irányokba szűkítse be a sejtek működését. Specializálódnak, tudnak ravasz dolgokat, de közben elvesztik totipotenciájukat és osztódó képességüket. A szervezetben több helyen találhatók őssejtek, illetve sérülés esetén bizonyos sejtek képesek genetikai szabályozó rendszereiket kicsit visszahangolni az őssejt állapot felé, hogy újra tudjanak osztódni, majd regenerálódni. De ez egy kétélű fegyver. A regeneráció ára az időnként előforduló rákos sejtek megjelenése. Daganatok gyakran sérülések, tartós gyulladások helyén alakulnak ki. Ugyanis, ha a regeneráció jegyében megjelenő őssejtek hordoznak bizonyos mutációkat, amelyek a sejtosztódás szabályozását érintik, a meginduló osztódást nem hagyják abba, elárasztják az egész szervezetet, rák alakul ki. Az egyszerűbb gerincesek még viszonylag jól tudnak regenerálni. Egy gyík képes farkát, elvesztett végtagját újra növeszteni, de egy emlős erre már nem képes. Valószínűleg azért, mert egy melegvérű, gyors anyagcseréjű állatban veszélyes, ha a sejtek könnyen visszaléphetnek őssejtté, hogy osztódással regenerációt végezzenek, mert ezzel a rákosodás esélye drasztikusan nő. Az evolúció megoldása erre az volt, hogy szigorúbb szabályokat épített be összetett szervezetünk védelmére, cserébe elvesztettük azt a képességet, hogy levágott karunkat újra növesszük. Az organoidok előállításához olyan állapotú sejtekre van szükségünk, melyeket a specializált állapotból egy beavatkozással (genetikai szabályozó hálózatok hangolásával) visszamozdítunk az őssejtek felé. Innen indulva tud a fejlődő organoidban elindulni az osztódás és differenciálódás folyamata, összetett szövetkapcsolatok kialakulása. Nyilván kényes a határ egy organoid és egy rák között, bár néhány kivétellel a rákos daganatokban nem alakulnak ki specializált szövetek. A kivételt a teratómák (tera- szörny, -toma-daganat) képeznek, amikor pluripotens őssejtek indulnak meg hibásan. Gyakran az iversejteket képző herében alakul ki ilyen. A teratóma egy olyan csírasejtes daganat, amelyben különböző szövetek és szervkezdemények torz, rendezetlen formában jelennek meg. Azért különleges (és sokszor megdöbbentő), mert egyetlen daganaton belül több csíralemezből származó szövetek is megtalálhatók egyszerre, fogak, porcok, mirigyek.

Az organoid fogalmát nagyjából tíz éve alkotta meg Hans Clevers Hollandiában. Azóta az organoidkutatás világszerte robbanásszerű fejlődésen ment keresztül, különösen az utrechti Hubrecht Intézetben, amely ma a fejlődésbiológia egyik központja. Az organoidok kis mennyiségű anyagból – például biopsziából (szövetminta) – indíthatók, és gyakorlatilag korlátlanul fenntarthatók. Már sikerült organoidokat létrehozni többek között bélből, gyomorból, emlőből, hasnyálmirigyből, prosztatából, petefészekből, tüdőből, májból – sőt még az agyból is.
Az organoidok előállítása általában őssejtekből indul, amelyek lehetnek felnőtt szövetből származó őssejtek vagy indukált pluripotens őssejtek (iPSC-k). Az iPSC-ket úgy hozzák létre, hogy egy kifejlett testi sejtbe – például bőr- vagy vérsejtbe – átprogramozó géneket, az ún. Yamanaka-faktorokat, juttatnak be. A Yamanaka-faktorok olyan transzkripciós faktorok (fehérjék, melyek a gének átíródását szabályozzák)– Oct4, Sox2, Klf4 és c-Myc –, amelyek képesek egy kifejlett testi sejtet visszaprogramozni pluripotens őssejt-állapotba. Amikor ezeket a géneket mesterségesen bejuttatják egy sejtbe, átalakítják a sejt genetikai szabályozási hálózatát: bekapcsolják az embrionális géneket, miközben elnémítják a differenciált sejttípusra jellemző programokat. A faktorok együttműködve átrendezik a kromatin szerkezetét, megváltoztatják a DNS-metilációt és a hisztonmódosításokat, így a génállomány újra „nyitottá” válik az őssejtekre jellemző szabályozás számára. Ennek eredményeként a sejt elveszíti korábbi identitását, és képessé válik arra, hogy szinte bármilyen sejttípussá differenciálódjon. Ezeket az őssejteket ezután egy háromdimenziós támasztó közegbe (például Matrigelbe) helyezik, amely lehetővé teszi a térbeli növekedést és az önszerveződést. Végül időben adagolt növekedési faktorokkal és jelátviteli molekulákkal irányítják a differenciálódást, így a sejtek maguktól kialakítják az adott szervre jellemző szerkezetet és sejttípusokat, létrehozva az organoidot.

A jó

Az organoidok óriási potenciállal bírnak az emberi egészséggel kapcsolatos kutatásokban. Regeneratív orvoslási szempontból különösen értékesek, mert egy apró mintából nagy mennyiségű, lefagyasztható és újraéleszthető szövet állítható elő. Ennek alapja az, hogy az organoidok felnőtt őssejteket tartalmaznak. Ezek az őssejtek normálisan is jelen vannak a szerveinkben, és sérülés esetén segítenek a regenerációban. Bár az ember regenerációs képessége korlátozott (szemben például a zebradánióval), minden szervben találhatók ilyen sejtek, amelyek megfelelő körülmények között egy miniatűr szervet képesek létrehozni. Ha ez nem működik, a sejtek akár iPSC-kké (indukált pluripotens őssejtekké) is visszaprogramozhatók.
Az organoidok a gyógyszerfejlesztésben is kulcsszerepet kaphatnak. Egy új gyógyszer kifejlesztése rendkívül drága, részben azért, mert az állatmodellek gyakran nem jelzik előre az emberi toxicitást. Bár az organoidok fenntartása munkaigényesebb, hosszú távon pontosabb előrejelzést adhatnak, és akár csökkenthetik az állatkísérletek számát. 

Mivel gyorsan nőnek és kisméretűek, egyetlen lemezen akár több száz gyógyszer hatása is tesztelhető.
Klinikai alkalmazásra eddig leginkább a cisztás fibrózis esetében került sor. Ennél a betegségnél egyetlen gén, a CFTR hibás, így az organoidok jól használhatók annak megjóslására, hogy egy adott gyógyszer hatékony lesz-e egy adott betegnél. Ha a betegből származó organoidok a gyógyszer hatására megduzzadnak, az azt jelzi, hogy a kezelés működni fog. Ez már ma is segít a személyre szabott terápiás döntésekben.
A rák esetében a helyzet bonyolultabb, de ígéretes. Friss eredmények szerint a vastagbélrákból származó organoidok megbízhatóan előrejelzik a kemoterápiás válaszokat, így elkerülhető lehet a felesleges, súlyos mellékhatásokkal járó kezelés azoknál, akiknél nem lenne hatásos.

A rossz

Az organoidoknak természetesen vannak korlátaik. Bár tartalmazzák egy szerv legtöbb sejttípusát és hasonló szerveződésűek, hiányzik belőlük az érhálózat, az immunrendszer és az idegi beidegzés. Emellett növekedésükhöz gyakran a sejtek vándorlását biztosító hálózatra, Matrigelre van szükség, amely egy egérdaganatból származó, biológiai eredetű hordozó alap (mátrix). Ennek összetétele tételenként változhat, ami kísérleti variabilitást okoz. Az organoidok mérete is eltérő lehet, még azonos környezetben is, ami további kihívásokat jelent. Bár fejlesztés alatt állnak szintetikus alternatívák, jelenleg a Matrigel még mindig a legelterjedtebb megoldás.

A gyönyörű

Az organoidok nemcsak hasznosak, hanem lenyűgözően szépek is. Kis méretük miatt teljes egészükben leképezhetők nagy felbontásban, akár szuperrezolúciós mikroszkópiával. Így olyan részletességgel vizsgálhatók sejten belüli struktúrák, ami hagyományos szövettani módszerekkel szinte elképzelhetetlen. A biológia ritkán mutatja meg magát ennyire látványosan: mini belek és mini vastagbelek, tökéletesen szervezett sejtrétegekkel.

Ma már világos, hogy a szervek nem csak az embrióban nőhetnek. A laborban is létrehozhatók, és az organoidok révén megismerhetjük bennük a jó, a rossz és a gyönyörű oldalát is.

Szerző: Gulyás Attila

A genetikai módosítás régen hosszú, drága és kiszámíthatatlan folyamat volt, mert a zigóta sejtmagjába injektált, vagy vírusokkal bevitt DNS darabok véletlenszerűen épültek be a genomba. A legjobb esetben szépen működött, amit terveztünk, mellékhatások nélkül. Leggyakrabban nem kaptunk génkifejeződést. De igen sokszor az is előfordult, hogy a génkifejeződés megtörtént, de a bevitt konstrukció a véletlen beépülés miatt, egy másik génbe szúródott be, ezzel megváltoztatva szabályozását, vagy tönkretéve a gén strukturális részét. Ezzel a transzgénikus állatnak egyéb tulajdonságai is megváltoztak. Nem árt, ha az ember tisztában van ezzel a lehetőséggel, amikor transzgénikus állatot használ. Csak olyat érdemes, ami alaposan tesztelve volt (az persze egy filozófiai kérdés, lehet-e minden, akár ismeretlen változásra is tesztelni). 

A CRISPR-technológia olyan pontos DNS-szerkesztő ollót adott a kutatók kezébe, amellyel célzottan, mellékhatások nélkül: géneket lehet kiütni, mutációkat lehet javítani vagy beépíteni, élő sejtekben, sőt állatokban lehet megváltoztatni egyetlen betűt a genom szövegében.
Segítségével emberi genetikai betegségek hátterében álló pontmutációk állatmodelljei rutinszerűen elkészíthetőek, és meggyógyíthatunk vele mutációkból adódó betegségeket.

Mi is az a CRISPR?

A CRISPR egy baktériumokból származó ún. adaptív immunrendszer. A lényege, hogy a baktériumok elmentik a vírusok DNS-darabjait a genomjukban. Ha ugyanaz a vírus újra támad, egy vezető RNS (guide RNA, gRNA) segítségével a Cas9 nevű fehérje felismeri és elvágja annak DNS-ét. Ez egyfajta bakteriális körözés, a WANTED plakátok alapján kapják el a bűnözőket.
A kutatók ezt a mechanizmust „átprogramozták”: a gRNA-t úgy tervezik meg, hogy a Cas9 ott vágjon, ahol mi szeretnénk a genomot módosítani. Jól tervezett gRNA-val nagyon pontosan, akár egyetlen bázispár is célozható, javítható, cserélhető.

Hogyan történik a CRISPR-szerkesztés?

A kutató kiválasztja azt a DNS-szakaszt, amelyet módosítani akar: pl. egy pontmutációt, amely emberi betegséget okoz (Huntington, SMA, epilepszia, autizmushoz köthető génhibák, stb.). Ennek alapján megtervezi a gNRS szekvenciáját, mely a DNS-en belül a kiválasztott helyre vezeti a Cas9 enzimet. A sejtbe többféleképpen juttathatók be a rendszer elemei: vírusvektorral (AAV), lipid-nanorészecskével (mint az mRNS vakcinák), elektroporációval (pl. zigótákba). A gRNS lényegében egy GPS ami egy adott koordinát keres a genomban. A Cas9 egy „molekuláris olló”, mely a DNS-t a megfelelő helyen elvágja, ez egy célzott kettős szálú DNS törést hoz létre. A vágás után a sejt kijavítja a törést – itt történik a szerkesztés. Két út lehetséges:
a) A sejt gyorsan, de pontatlanul ragasztja vissza a DNS-t -> kis törlések/beszúrások (insertion). Hibás kijavítás -> génkiütés. Ez kikapcsolja (knock-out) az adott gént.
b) Pontos javítás -> génjavítás / mutáció beépítés. Ehhez egy javítósablont is kell adnunk (donor DNS-t), a javításhoz a sejt ezt használja fel, és pontosan azt a mutációt építi be, amit kérünk: -> új pontmutáció bevitele pl. betegségek állatmodelljeinek előállítására), -> hibás gén javítása (gyógyítás).

Miért forradalmi ez idegtudományban?

1. Pontmutációs állatmodellek készíthetők évek helyett, hetek alatt. Régen generációk kellettek egy transzgénikus állathoz. CRISPR-rel egyetlen egér zigótát megvágunk, beépítjük a kívánt mutációt, a született állat már hordozza a génhibát.
Ma rutinszerűen készülnek: autizmushoz kötött SHANK3 mutációk, epilepsziás SCN1A/SCN2A variánsok, neurodegeneratív modellek (pl. ALS, Huntington), dopaminrendszer vagy ioncsatornák célzott módosításai
2. Génterápiák. CRISPR egyre gyakrabban kerül a klinikumba, ahol hibás, betegséget okozó géneket javítanak: sarlósejtes vérszegénység, béta-thalassemia, retina betegségek, májenzim-defektusok, izomdisztrófiák, leukémiában T-sejtek módosítása. Az első CRISPR-alapú génterápia 2023-ban kapott engedélyt sarlósejtes vérszegénység gyógyítására, a hibás hemoglobin gént cserélik jóra.
A központi idegrendszerben AAV-vektoros CRISPR-tesztelések zajlanak gerincvelői izomsorvadás, amiotrófiás laterálszklerózis és neuronális ioncsatorna-betegségek kezelésére.

Röviden: A CRISPR úgy működik, mint egy szövegszerkesztő a genomban: a gRNA a kurzor, a Cas9 az olló. A sejt javító rendszere a „helyesírás-ellenőrző”. A kutató dönt arról, hogy törlünk, átírunk vagy beszúrunk egy betűt.

Szerző: Gulyás Attila

A fiziológiai módszerek lajstromozása környékén bemutattam a transzgenikus technológiával sejtekben kifejezhető Ca érzékelő molekulákat (szenzorok, GCaMP család), melyek lehetővé teszik nagy sejtpopulációk aktivitásának, illetve egyedi sejtek jelintegrációs folyamatainak mérését. Azonban számos más optikai szenzor-molekula család létezik. Ezeket mutatjuk be ebben a bejegyzésben. Az optikai szenzorok erőssége, hogy képalkotó eljárásokkal, fénysugarakat rögzítő kamerákkal gyorsan, 2 vagy 3D képet lehet nyerni egy nagy terület, pl. egy agykérgi terület vagy kisebb állatok esetében az egész agy aktivitásáról.

Az elektromos jelek méréséhez képest ezek a szenzorok sokkal több „csatornát” (pixelt) engednek meg, az elektromos zajokra nem érzékenyek, és ha kívánjuk kiválasztott sejtcsoportokban fejezhetők ki.

Amikor egy indikátor molekula az általa érzékelt anyagot megköti, megváltoztatja elektronszerkezetét vagy konformációját, 3D szerkezetét (elcsavarodik). Ezek következtében fényelnyelési és fénykibocsájtási spektruma megváltozik, azaz más színben vagy mennyiségben bocsájt ki fényt gerjesztés hatására, máshogy fluoreszkál. A szenzorok lehetnek: a) kémiailag szintetizált molekulák, b) fluoreszcens fehérjék, vagy ezek kimérái más fehérjékkel, c) olyan fehérjék, amelyek kémiai szintetikus molekulákat kötnek. A b esetben gyakran egy kiméra (két eltérő fehérjéből összeszerkesztett) fehérjét készítenek, melynek egyik része felelős az érzékelendő anyag kötéséért, a másik pedig a fény kibocsájtásért. A fehérjéket úgy szerkesztik egymáshoz, hogy amikor a kötő rész anyagot köt, térszerkezete megváltozik (megcsavarodik) és megtekeri a fényt kibocsájtó molekulát, mely ennek hatására megváltoztatja fluoreszcens tulajdonságait. Ez a moduláris megközelítés lehetővé teszi különböző szenzorok és eltérő színű fluoreszkáló fehérjék kapcsolását. Az ingerületátvivőanyag és metabolikus érzékelők esetében olyan megoldás is létezik, hogy egy enzim hatású fehérje reagál a vizsgált anyaggal és a reakciótermék bocsájt ki fényjelet.

Nézzük milyen optikai szenzorokat ismerünk. Kezdjük a legismertebbel.

A. Kalcium-érzékelő szenzorok (Ca-imaging)

Mit mérnek?
Az idegsejtekbe depolarizációját (aktiválódás) követő Ca²⁺-ion beáramlást érzékelik. Ez egy késleltetett, de nagy amplitúdójú jel. Két fő típusuk van: kémiai Ca-festékek (pl. Fura-2, Fluo-4) és genetikailag kódolt Ca-indikátorok (pl. GCaMP6, jGCaMP7, GCaMP8). Fő előnyeik:
-Nagy jelváltozás (ΔF/F=az intenzitás változása/összes intenzitás, gyakran 100% fölött), ezért jó jel/zaj viszonyt adnak. 
-Könnyen alkalmazhatók in vivo is, célzottan expresszálhatók adott sejttípusokban. 
Korlátaik: 
-Lassú kinetika (több 10–100 ms-be és kikapcsolás), mivel a Ca²⁺-ionoknak be kell jutnia a sejtbe és hozzákötődnie a festékhez. Ezért az akciós potenciál időzítését pontatlanul követik, illetve a sejt Ca²⁺ szintje és az akciós potenciál közöttibonyolult összefüggés miatt nem is teljesen egyértelmű milyen viszonyban áll az akciós potenciállal, azaz mennyire jól jelzi a sejt kisülését.

B. Feszültség-érzékeny optikai szenzorok (Voltage Imaging)

Közvetlenül a membránfeszültséget mérik, elméletben milliszekundumos pontossággal. A Ca szenzorokhoz hasonlóan két fő kategóriájuk van: 1) feszültség-érzékeny festékek (VSD-k, pl. ANEPPS, RH-1691, Di-4-ANEPPS), melyek membránba épülő kis molekulák, amelyek fluoreszcenciája változik a transzmembrán elektromos térrel. 2) genetikailag kódolt feszültségindikátorok (GEVI-k, pl. ASAP1–5, Ace2N, ArcLight, QuasAr, SomArchon, Voltron). Ezek fehérjék, amelyeket adott sejtekben expresszálunk, és a membránfeszültség módosítja a fénykibocsájtásukat.
Időbeli felbontásuk elérheti vagy meghaladhatja a patch-clamp elektródákkal mért elektromos jelek sebességét. Sajnos azonban egészen mostanáig sok gyakorlati probléma adódott velük, ezért maradt el 10 évvel a használatuk a Ca indikátoroktól. Nagyon kicsi jelváltozást mutattak (ΔF/F gyakran 1–5%), emiatt nehéz volt jelüket a zajból kibogarászni. Ráadásul gyors reakciójukat nem tudták követni a korábbi képalkotó sebesség rendszerek. Az elmút 5 évben nagy fejlődés történt ezen a területen, erről a következő bejegyzésben számolunk be.

C. Neurotranszmitter-érzékelő indikátorok

Nem elektromos aktivitást, hanem kémiai hírvivők felszabadulását mérik, jelzik, gyorsak.
Típusaik:
Glutamát-érzékelők: iGluSnFR, SF-iGluSnFR, iGluu
GABA-érzékelők: iGABASnFR
Dopamin-érzékelők: dLight1, GRAB-DA
Acetilkolin-érzékelő: GACh

Szemléletes térképet adnak mind a jelfeldolgozásban fontos gyors transzmitterek (Glutamát, GABA), mind a modulációban fontos, kicsit lasabban ható (Dopamin, ACh) transzmitterek szinaptikus aktivitásáról. Nem közvetlenül a neuron tüzelését mérik, hanem a felszabadult ingerület átvivő anyag jelenlétét. De ez nem feltétlenül hiba, hiszen a hatást a felszabadult transzmitter váltja ki és erre vagyunk kíváncsiak.

D. Metabolikus és pH-érzékelő szenzorok

Az idegsejtek anyagcsere folyamatiról (energiaszint) adnak képet (pHluorin, Peredox-NADH/NAD+ arány) a genetikai metabolikus bioszenzorok
Az idegsejteknek a hálózati aktivitás függvényében hirtelen nagyon sok energiára lehet szükségük az akciós potenciálok és a membránpotenciál fenntartásához. Elsődleges tápanyagok a glükóz lebontása két lépésből áll a glikolízisből, a cukor elemekre bontásából és a sejtlégzésből, ahol is az elemeket a mitokondriumok elégetik és a keletkező NADH-n keresztül ATP-ben tárolja az energiát, amivel aztán fizetnek a drága membrán potenciál fenntartó folyamatokért. A glikolízis egy lassú folyamat, azaz meghatározza azt, hogy az idegsejt mennyi energiát tud időegység alatt termelni. Szerencsére sürgős esetekben az asztrociták (gliasejtek) segítenek a neuronoknak. Ők sok glükózt képesek felvenni és az türelmesen elkezdik lebontani glikolízissel, többek között tejsavvá (laktát). Amikor az idegsejtek aktívvá válnak, glutamátot (a serkentő átvivő-anyagot) és K+ ionokat bocsájtanak a sejtközötti térbe. Mindkét anyagot érzékelik a gliasejtek és elkezdenek az idegsejteknek tejsavat átadni, amit ők mitokondriumaik segítségével gyorsan tudnak égetni és feltölteni ATP készletükt. De a gliák az idegsejtek NADH és ATP szintjét is figyelik, hogy mikor kell segíteni.

A metabolikus optikai szenzorok tehát azt teszik lehetővé, hogy valós időben lássuk egy idegsejt energia- és redoxállapotát. A NADH/NADPH-érzékelők megmutatják, mennyire aktív a mitokondrium, a sejtek elsődleges erőműve. Tud-e elegendő energiát adni a sejtlégzés vagy megnőtt-e az oxidatív terhelés. Az ATP- és laktát (tejsav)-szenzorok feltárják, hogyan oszlik meg az energia a neuronok és a glia között: mikor fogy el az ATP egy szinapszisban, és mikor segít be az asztrocita laktáttal. 

Ezek a szenzorok összességében nem egy-egy molekulát mérnek, hanem a sejtműködés mögött álló energetikai és kémiai folyamatokat: azt, hogy a neuron és a glia hogyan osztják be az energiát, mikor alakul ki energiahiány, és hogyan támogatják egymás működését.

A pH-érzékeny mutatók jelzik a szinaptikus és egyéb szállító vezikulák állapotát és a sejt metabolikus váltásait, így közvetlenül követhető az exocitózis és a sejt kémiai környezetének változása. A dolog hátterében az áll, hogy egy szinaptikus vezikula belseje savas, meg van töltve H+ ionokkal, ugyanis ezek kiáramlása hajtja azokat a pumpákat, amik a transzmittereket csomagolják a vezikulákba. Amikor egy vezikula kiürül, a H+ ionok kiáramlanak, azaz tartalma lúgosabbá váli, a pH nő. Amikor endocitózissal újra alakul, pH-ja ismét esik. Azaz, a pH mérésével a vezikulák aktivitása és ciklusa mérhető.

Azzal folytatjuk, hogy milyen fejlődés történt a közelmúltban, az idegrendszer kutatásában használt optikai érzékelők Szent-Grálja, a feszültségérzékeny szenzorok terén.

Szerző: Gulyás Attila

Egy idegsejtre másodpercenként sokezer serkentő és gátló szinaptikus áram érkezik, melyek bonyolult módon hatnak kölcsön. Az áramok a dendriteken terjedés közben erősödhetnek, gyengülhetnek, gyakran kalcium tüskéket váltanak ki. 

Mindezek eredményeként kellően serkentett esetben akciós potenciálok vagy kisüléssorozatok (burst-ök) keletkeznek az axon iniciális szegmentumon. A hab a tortán, hogy az állat viselkedésével összefüggésben felszabaduló moduláló ingerületátvivő anyagok hatására (acetil-kolin, szerotonin, dopamin, noradrenalin, etc.), az idegsejtek eltérő ingerfeldolgozási módokba kapcsolnak, azaz állapotonként máshogy terjednek és összegződnek a szinaptikus áramok.
A jelfeldolgozás megértéséhez, hagyományosan elektródákkal (hegyes, patch-clamp) mérik a sejtek és dendritek potenciálját, és a rajtuk folyó áramokat — de ezekkel egyszerre csak egy vagy kevés ponton tudunk mérni. Ráadásul ezek a módszerek érzékenyek az állat vagy preparátum mozgására, emiatt nehezen használhatók, mivel az 1-20 µm átmérőjű sejteket és dendriteket nehéz megtartani az ehhez képest hatalmas elektród végén.

Képzeljük el milyen jó lenne, ha ahelyett, hogy elektródákat kellene szurkálnunk idegsejtekbe vagy agyterületekre, csak ránéznénk egy idegsejtre, és látnánk hogyan terjednek és összegződnek rajta az elektromos jelek, vagy látnánk az agyi hálózatokban csillogó mintázatokat. Erre ugye történt kísérlet a kalcium szenzorok terén, melyek használatával sokat megtudtunk a sejtek jelintegrációjáról. De, mint korábban írtam, ezek a szenzorok 50-100msec késéssel és meglehetősen nagy bizonytalansággal írják le a sejtekben történő feszültségváltozásokat. Ezért kísérleteznek jóideje a feszültség-érzékeny festékekkel (VSD=voltage sensitive dye) és genetikailag kódolt feszültség-érzékeny fehérjékkel (GEVI= genetically engineered voltage indicator), melyek gyorsan és közvetlenül érzékelik a membránpotenciált. Azonban számos technikai akadály miatt ezek az indikátorok gyenge teljesítményt nyújtottak. Mik voltak ezek az okok?

(1) A jel nagyon kicsi volt: Míg a Ca-szenzorok 50–150% fluoreszcenciaváltozást tudnak, a GEVI-k 2008–2016 között gyakran 1–5% ΔF/F tartományban mozogtak. Ez extrém jel/zaj problémát okozott. Hogy ez miért baj, legjobban azzal lehet szemléltetni, amikor nappal valaki be akar nézni egy ház ablakán. Nem fog sokat látni abból, ami bent történik, mivel kívül nagyon erős a háttérfény, és a visszaverődő fény sokkal erősebb, mint ami bentről kijön. Pedig hát este (vagy ha kezünkkel leárnyékoljuk a háttárfényt) jól látjuk mi történik bent, holott semmivel több fény nem jön ki bentről. Mindössze az összes fényhez képest kicsi a belső fény.
(2) A membránpotenciál-változás nagyon gyors (az akciós potenciál 1msec): Az érzékelésre használt kamera/képalkotó rendszer, illetve a szenzor fotofizikája nem tudta ilyen gyorsan követni a változást, a jelek elmosódtak.
(3) A festékek vagy nem voltak stabilok, vagy mérgezőek voltak: A szintetikus VSD-k egy része fototoxikus volt, megvilágítás hatására sejtkárosító szabadgyököket szabadított fel. A GEVI-k membráncélzása instabil/gyenge volt. Sok esetben a festék nem jutott megfelelően a membránba. Márpedig ott kell lennie, hiszen a sejthártya két oldala közötti feszültségkülönbségre vagyunk kíváncsiak. A sejtben maradt fehérje fluoreszcenciája nem változik, és emiatt háttérjelként rontja a jel-zaj viszonyt.
(4) A fényút és a szóródás (in vivo) sokkal kritikusabb a feszültség-képalkotásnál, mivel a kis jel miatt bármilyen szóródás vagy háttérfény gyengíti a hasznos jelet.
(5) A kalcium-imaging technikailag sokkal „megbocsátóbb” volt: nagy jel, lassú, „szélesen integráló” válasz. Jól működtek a már korábban standardizált két-foton rendszereken és széles körű optogenetikai kompatibilitás mutattak.

Miben javultak a feszültség-érzékeny szenzorok 2017–2024 között?
A régi GEVI-k (ArcLight, 2011) lassú válasza és gyenge jelkibocsájtása (1–5% ΔF/F) miatt egyedi sejteken alig volt detektálható AP-válasz. Ezeket felváltották a modern GEVI-k (ASAP3, ASAP4e, Ace-mNeon, Voltron / SomArchon / QuasAr3, 2018–2024), melyek gyorsak, kiváló fényerővel rendelkeznek, 10–20% ΔF/F-t mutatnak, azaz egyetlen AP-re jelet adnak. Sokuk vörös-eltolt fénnyel gerjeszthető és mivel a vörös fény kevésbé szóródik az agyszövetben, az agy mélyéről is lehet mérni velük. A sejttestet célzó Archon-t kifejezetten akciós potenciál (AP) követésére optimalizálták. Ezekkel az indikátorokkal már valódi akciós potenciál szintű felbontás lehetséges in vivo (azaz élő, viselkedő, ép agyú állatban), kHz-es sebességgel (azaz 1msec felbontással).

Mi fejlődött mindehhez?
(1) Jel/zaj drámai javulása: ΔF/F növelés és abszolút fényerő növelése. 
(2) Sebesség: a kinetika ma már elég gyors, a szenzorok időállandója ~1 ms környékén van, tehát AP-ket torzítás nélkül követnek. Ráadásul küszöb alatti membránfeszütség ingadozásokat is mérnek (amit Ca-imaging nem tud) és így nagyot léphetünk előre a sejtek jelintegrációs tulajdonságainak megértésében. Ami nagyon fontos a finom kölcsönhatásokat is láthatjuk, nem csak az APket. Mondhatjuk azt, hogy a tömegben nem csak mérges kiabálást halljuk, hanem a halk beszélgetéseket is, amelyek gyakran többet mondanak.
(3) A membráncélzás és kifejeződés stabilitása javult: a festékek és fehérjék membrán-horgonyzó területeinek optimalizálásával (pl. Kv2.1 targeting) hatékonyabban épülnek be a sejtmembránba, illetve új fluorofórokat (fénykibocsájtó részeket: xGreen, mNeonGreen, mRuby3 variánsok) fejlesztettek. Ezek eredményeképpen nagyon egyenletes membránjelet, stabil hetekig jelen levő expressziót, és csökkenő fototoxicitást értek el. Azt se felejtsük el, hogy a genetikus módszerekkel el lehet érni, hogy a feszültség érzékelők csak egyes sejtekben fejeződjenek ki (bár ezt már a Ca indikátorok is tudták).
(4) Hibrid rendszereket fejlesztettek, melyekben egy fehérje specifikusan köt egy festéket (pl. Voltron). Ezekben a GEVI egy fehérjeváz, amelyhez kémiai fluorofór kötődik, így kombinálódik a szintetikus festékek fényereje a genetikai célzás pontosságával. Ez kétszeres-háromszoros jel/zaj erősödést hozott.
(5) A sebességnövekedést a képalkotó technológiák is követték. Megjelentek a nagy sebességű kamerák (sCMOS -> neurolight CMOS), a feszültség-leképezéshez (voltage-imaging) optimalizált LED-gerjesztő rendszerek, vörös-eltolt GEVI-k (635–660 nm), melyeket lehetővé teszik az agy mélyebb rétegeinek vizsgálatát.

Ennek eredményeképpen 2019–2024 között több tanulmány jelent meg, amelyek viselkedő egérben mutatja be egyetlen sejt feszültségváltozásait. Az agykéregben oszlop-szintű aktivitást térképeznek, küszöb alatt dendritikus jeleket mérnek a mélyen fekvő hippokampusz, agykéreg, talamusz és striátum területein.

A voltage-imaging végre elkezdte megmutatni, egyszerre egész hálózatokban és sok sejten azt, amit az elektrofiziológia eddig nehezen, körülményesen és évtizedek alatt a kulcslyukon keresztül meglesett: az akciós potenciál pontos időpontját és kialakulásának helyét, a küszöb alatti dendritikus jeleket, a sejtek közötti szinkronitást, a hálózati állapotok gyors váltásait. A kalcium-imaging továbbra is hasznos: több száz vagy ezer sejt aktivitását láthatjuk egyszerre vele. A két módszer nem versenyez, hanem kiegészíti egymást.

Mit jelent mindez laikus nyelven?

A feszültség-leképezés korábban olyan volt, mintha nagyon gyors eseményeket akartunk volna lefotózni egy régi mobiltelefonnal a sötétben. Mostanra viszont a kamera gyorsabb és fényérzékenyebb lett, a festék sokkal fényesebben világít, és célzottan oda tudjuk vinni, ahol történik az akció. Ezért történik az, hogy a 2020-as években a voltage imaging végre megbízható, gyors, élő állatban is működik, és olyan információt ad, amit Ca-imaging nem tud (pl. szinaptikus áramok terjedését és kölcsönhatását láthatjuk dendriteken, az AP-k időzítését msec pontossággal).

Egyenlőre ezzel zárjuk is az #agytecnikák mondern módszerekről szóló sorozatát. 

Szerző: Gulyás Attila

Ez lesz egy időre az utolsó #agytechnikák bejegyzés, de erre még szükség van ahhoz, hogy visszatérhessünk az #agyséta rovat megakadt gondolatmenetéhez, amiben az agykérgi területek (meta-hálózatok) dinamikáját mutatjuk be.

Itt az ideje, hogy beszéljünk arról, hogy az elmúlt másfél évtizedben mi volt az a technikai fejlődés, ami lehetővé tette a neuropszichológia számára, hogy az idegsejtek működése, valamint a gondolkodás, a döntés, a tudatosság folyamatai között megtalálhassuk a kapcsolatot.
Az előző #agyséta bejegyzésekben, ahol a hippokampusz működését és állapot-átkapcsolásait mutattuk be, elsősorban olyan elektrofiziológiai módszereket használtunk, melyek fél évszázada elérhetőek: egyedi sejtek és a kishálózatok működését mértük intracelluláris (egyedi sejtekbe szúrt) és EEG elektródákkal (melyek a hálózat kollektív aktivitását mérik). Ezáltal megismertük az összefüggést a hálózat és a sejtek működése között.

Elsősorban a számítási kapacitás hihetetlen megnövekedése miatt, a közelmúltban megjelentek olyan új módszerek: 1) az optogenetikával kombinált két-foton mikroszópia, 2) a nagyon sok csatornás EEG és sejt elvezetések, valamint 3) a funkcionális magmágneses rezonanciás képalkotás (functional Magnetic Resonance  Imaging, fMRI), melyek lehetővé teszik, hogy egyszerre több ezer idegsejt és több száz agyterület működését figyeljük meg, akár szabadon mozgó, feladatokat végző állatokban -vagy a nem invazív módszerek (fejtetői EEG és fMRI) esetében- emberekben. 

Kezdjük a sejtek és kishálózatok felől, és haladjunk az agyi területek működésének vizsgálata felé. A molekuláris biológusok által fejlesztett optogenetika lehetővé teszi, hogy az idegsejtek DNS-ébe olyan géneket építsünk be, melyeket kifejezve az idegsejtek vagy fényt bocsájtanak ki, amikor működésbe lépnek (erős leegyszerűsítés de a célunknak megfelel), vagy fény hatására működésük nő avagy csökken. Két-foton mikroszkópokkal, a működő agyban készíthetők mozik arról melyik pillanatban mely idegsejtek kapcsolódnak be. Ezeket a módszereket részletesebben bemutattuk jónéhány #agytechnikák bejegyzésben (kalcium és voltage imaging). Használatukkal tizedmásodperces felbontással vizsgálhatjuk több ezer idegsejt működését. Emlékeztek? Az idegsejtek aktivitásmintázata hordozza az információt, azaz ezzel a módszerrel kiolvashatjuk az agy kódját, információ tartalmát, és annak változását pillanatról pillanatra. 
A másik módszer, mely alkalmas több száz idegsejt működésének meglesésére, az a szilikonból félvezető technikákkal készült elektróda fésűk alkalmazása. Egy-egy ilyen összetett elektróda több ezer elektromos érzékelő végződést hordoz, melyekkel a közelükben levő sejtek működése mérhető. Ennek a módszernek a térbeli felbontása nem olyan jó, mint az optogenetikai módszeré, viszont az időbeli sokkal jobb, a másodperc ezredrésze alatt zajló folyamatokat képes megfigyelni. Ezekről is írtunk már bővebben. Mivel ezekhez a módszerekhez az agyat meg kell bolygatni, vagy azért, hogy transzgénikus fehérjéket fejezzünk ki, vagy azért, hogy elekródákat juttassunk a sejtek közelébe, értelemszerűen ezek a kísérletek emberek esetében nem végezhetők el. De mivel az emberi és állati agyak felépítési alapelvei jelentősen megegyeznek, már így is nagyon sokat tanultunk az agy információfeldolgozásának alapelveiről. 

Míg ezek a módszerek finom térbeli felbontásúak és alkalmasak a kishálózatok működési törvényszerűségeinek feltárására, nem képesek egész agy méretben működni (apró agyak -mint például zebrahal vagy fonálféreg- esetében igen). Szerencsére léteznek komplementer módszerek, mint a sokcsatornás EEG és az fMRI, melyek alkalmasak akár egy egész emberi agy vizsgálatára. A sokcsatornás EEG vizsgálatok során több száz EEG elektródát helyeznek el a koponyatetőn, melyek milliszekundumos időbeli felbontással mérik, hogy mi történik a különböző agykérgi területeken, miközben a kísérleti alany valamilyen feladatot végez. Míg ennek a módszernek (hasonlóan az előző elektrofiziológiai módszerekhez) nagyon jó az időbeli felbontása, addig a térbeli felbontása csak centiméteres szinten mozog, és csak az agykéreg működésének vizsgálatára alkalmas, mert az agy mélyéről nem érkeznek értékelhető elektromos jelek a koponya felszínre. 
Az fMRI ezzel szemben nagyon jó térbeli felbontással rendelkezik. A legújabb 9.5 vagy akár 11.7 Tesla erősségű mágnessel felszerelt gépek térbeli felbontása milliméter alatti, megközelíti az agykérgi oszlopok méretét. Sajnos cserébe időbeli felbontásuk nem olyan jó, mivel nem közvetlenül az idegsejtek aktivitását, hanem az aktív idegsejtek oxigénfelvétele miatt megváltozott véroxigén szintet mérik, mely 1-2 másodperc késéssel követi a sejtek aktiválódását. Az időbeli felbontást a nagyon erős mágnesek sem tudják javítani. 

Szerencsére a kishálózatok (sejt szint) és ameta-hálózatok (agyterületek) működését mérő elektromos és képalkotó módszerek kiegészítik egymást a tér és az időbeli felbontásban. Ráadásul az fMRI felbontása egybeesik azzal a léptékkel, amiben optogenetikai módszerekkel tudjuk egyszerre akár többezer sejt aktivitását mérni.

Azaz felépült a híd az agyműködés sejt- és viselkedés-szintű vizsgálata között. Meg tudjuk nézni, hogy egy bonyolult döntési folyamatban mely agyterületek idegsejtjei vesznek részt, és hogyan működnek a döntés különböző fázisaiban. A megismerés alagútját két irányból ásó diszciplínák képviselői, a neurobiológusok és a pszichológusok - 200 év után - középen összeértek, és megerősödött a neuropszichológia diszciplínája.

Azt, hogy a hatalmas mennyiségű mért adatból hogyan értjük meg az agyműködés szabályait, a következő bejegyzésben mutatja be.

Szerző: Gulyás Attila

Hogy az előző bejegyzésben bemutatott mérések alapján megértsük, hogyan hangolódnak egymáshoz az egyterületek az agyműködés során, egy meglehetősen bonyolult rejtvény kell megfejteni: az egy-egy kísérlet során keletkező hatalmas adatmennyiséget (naponta akár több TB) zajmentesíteni, majd értelmezni is kell. Ebben matematikusok és fizikusok által fejlesztett összetett statisztikai módszerek és modellek segítenek. 

A nagyszámú csatornán idősorokat rögzítünk. Azaz, hogy egyes időpotkban hogyan változika a jelek erőssége (EEG: feszültség, fMRI: vérátáramlás). A rögzített idegi aktivitás elemzése rendszerint azzal kezdődik, hogy a kutató kezelhető formára alakítja az adatokat. A több száz vagy ezer párhuzamos jelben rengeteg az átfedő információ, ezért első lépésként gyakran dimenziócsökkentő eljárásokat alkalmaznak.

Ilyenkor olyan matematikai módszerek, mint a főkomponens-analízis (PCA), faktor analízis, vagy különféle látens változós modellek segítenek megtalálni azokat a rejtett mintázatokat, amelyek az idegsejt populációk, agykérgi területek közös működését adják. Ez nem magyarázat, inkább térkép: megmutatja, merre érdemes tovább keresni.

Ha már látjuk, hogyan mozog együtt a rendszer, a következő kérdés az időbeliség. Idősorelemző eszközökkel vizsgálható, hogy egy aktivitás mennyire függ a saját múltjától, illetve, hogy különböző csatornák között milyen összefüggésben jelennek meg hasonló változás. A spektrális, Fourier és wavelet elemzések, feltárják egy-egy csatornán belül a ritmusokat és oszcillációkat, míg a koherencia azt mutatja meg, hogy az egyes csatornák (agyterületek működése) mennyire összehangoltak.

A fizikusok a jelek együttmozgását a koherenciával jellemzik. Két jel akkor koherens ha a csatornákon hasonló frekvenciák, hasonló fázisokban jelennek meg.

Ha sok csatornánk van (márpedig az fMRI és sokcsatornás EEG esetében igen). Akkor páronként ki lehet számolni a csatornák közötti koherenciák összefüggéseit és egy ábrán megjeleníteni. Ezen mintázatok alapján lehet kiszámítani, hogy egyes időpillanatokban mely agyterületek működnek együtt.

A harmadik lépésben a hangsúly gyakran az együtt mozgásról az irányokra, egyedi eltérésekre tolódik. Itt olyan megközelítések kerülnek előtérbe, amelyek azt vizsgálják, vajon egy jel változása segít-e előre jelezni egy másik későbbi alakulását. A kauzalitás elemzések (pl. Granger), az információelméleti mutatók (transfer entropy) vagy a biológiai modellekbe ágyazott kauzális becslések, mind azt próbálják eldönteni, hogy puszta összefüggésekről vagy tényleges hatásokról beszélhetünk-e. Ezek az eredmények már hálózati értelmezések felé vezetnek.

Végül a kutatók a teljes rendszert kapcsolati struktúraként kezeli. A régiók vagy sejtek csomópontokká, az együttműködések élekké válnak, és gráfelméleti eszközökkel vizsgálható, mely elemek központiak, hogyan alakulnak ki modulok, vagy mennyire hatékony az információ terjedése. Ezzel párhuzamosan gyakran megpróbálják „kiolvasni” az aktivitásból a viselkedést vagy az inger jellemzőit, különböző dekódoló algoritmusok segítségével (pl. gépi tanulási modellek). A munkamenet így a nyers jelektől eljut a rendszer szintű működésig: a matematikai elemzés lépésről lépésre alakítja az adatokat értelmezhető idegtudományi állításokká.

A sejtszintű vizsgálatok elemzése megmutatja, milyenek a kódolás szabályai, hogyan alakulnak egymásba az idegsejtek mintázatai, valamint, hogy az eltérő EEG állapottal jellemzett hálózati állapotokban miben tér el egymástól a sejtek működése. A meta-hálózatok, agyterületek kölcsönhatásának vizsgálata pedig megmutatja, mikor, hogyan és milyen szabályok szerint hatnak kölcsön az agyterületek.

A negyedik szerveződési szint (tudatosság dinamikája) megértéséhez fontos, hogy elmerüljünk az agyterületek pillanatról pillanatra változó (dinamikus) kölcsönhatásainak tér és időbeli összefüggéseiben. A sokcsatornás EEG és az fMRI mérések elemzése alapján a kutatók azt találták, hogy nem csak az agyterületek aktivitása változik egy feladat során, hanem az is, hogy mennyire vannak összehangolva, mennyire együtt változnak. Ezeknek az összefügéseknek az ismeretében hálózatelemzési módszereket használva felrajzolták azt, hogy egy adott pillanatban milyen agyterületek lépnek kapcsolatba egymással, és ezek a kölcsönhatások hogyan változnak. Rávetítve ezt az állandóan változó hálózatot (gráfot, mely csomópontokból és kapcsolatokból áll) az agyterületek korábban megismert, eltérő feladatokat ellátó területeinek térképére, megérthetjük milyen típusú feldolgozás történik egy-egy pillanatban. Fontos kiemelni, hogy itt tized-század másodpercek alatt változik az egymással kapcsolatban levő területek kapcsolatrendszere egy feladat elvégzésének eltérő fázisaiban.

Ezekből a vizsgálatából kiderült, hogy az agynak feldolgozási állapotai vannak. Gyors egymásutánban, a környezetből vagy a szervezetből érkező információ függvényében kapcsol az agy működési módok között, amelyekben az agyterületek eltérő hálózatokba kapcsolódnak. Az eltérő időben, eltérő feladatokat megoldó, időlegesen összekapcsolt hálózatok lehetnek részben átfedőek, de elkülönültek is. Hasonlóan ahhoz, ahogy például egy asztalosműhelyben különböző feladatok megoldásához más szerszámokat és műveleteket használunk. De akadnak olyan szerszámok vagy műveletek is, amiket sok esetben gyakran együtt használunk, és olyan esetek is, amikor eltérő szerszámkészletekkel eltérő műveleteket végzünk.

A következőkben ezeket a funkcionális hálózatokat nézzük meg részletesebben.

Szerző: Gulyás Attila