Immunohisztokémia
Egyszerű immunfestés
A tárolt metszeteket foszfát pufferes (PB) mosások után TBS-be (TRIS-szel pufferelt fiziológiás sóoldat, pH=7.4) helyezzük át az inkubálás további lépéseihez, mivel a továbbiakban minden szérumot TBS-ben hígítottunk, és az egyes inkubációs lépések között TBS-sel (3X10 perc) mossuk a metszeteket. Az endogén peroxidáz blokkolására H2O2 1%-os oldatát használjuk, nem-specifikus kötőhely blokkoláshoz normál ló- vagy kecskeszérumot (NHS, NGS) vagy szarvasmarha szérum albumint (BSA) használunk.
Ezt követi a primer szérumokban történő inkubáció 2 napig, 4°C-on. A kutatástól függően számos neuronális, gliális és vaszkuláris elemet meg tudunk jelölni. Az antitestek specificitását a forrás tesztelte. Minden antitest festési mintázatát mi is megvizsgáltuk, állati és emberi szöveten, többféle koncentrációban, hogy az optimális alkalmazási körülményeket megállapítsuk. Azokban az esetekben, ahol több antitestet is használunk, minden esetben külön kísérletben vetettük össze az antitestek festését, hogy megbizonyosodjunk, ugyanazt festik. Egy kísérletsorozatban mindig ugyanazt az antitestet használjuk.
Ezután a primer szérumot felismerő biotinilált szekunder szérumot tesszük a metszetekre. Ezt követi az avidin-biotin-tormaperoxidáz komplexszel történő inkubáció. A metszeteket kimossuk TBS-ben, majd TRIS pufferben (TB, pH=7.6) és 0.05M koncentrációjú DAB-ban (3,3'-diaminobenzidin-4HCl) előinkubáljuk 20 percig, ezután a DAB kromogénhez 0.01%-os hidrogénperoxidot adva előhívjuk. Az immunpozitív sejtekben barna reakció végtermék halmozódik fel.
1. ábra: SMI32-immunfestéssel jelölt humán óriás piramissejtek (Betz sejtek), Nissl szövettani festéssel kiegészítve (lilával jelölt struktúrák).
A metszeteket ozmifikáljuk (1% OsO4, változó ideig), felszálló etanol sorban (1% uranil-acetátot teszünk a 70%-os alkoholba, 40 percig) és acetonitrilben dehidráljuk, majd Durcupanba (ACM; Fluka) ágyazzuk.
A fénymikroszkópos vizsgálat után a részletes vizsgálatot igénylő területeket átágyazzuk, ultramikrotómmal sorozatmetszetet készítünk belőlük és elektronmikroszkóppal vizsgáljuk. A kontroll és patológiás szöveteket ugyanazoknak az eljárásoknak vetjük alá.
2. ábra: Humán Betz sejt parvalbumin (PV) jelölt elektronmikroszkópos képe.
Többszörös fluoreszcens immunfestés
A lépések az előbbiekhez hasonlóan TBS oldatban történnek, az inkubálási lépések között mosási periódusokkal. 1% H2O2 oldatos inkubálás során a humán metszetek autofluoreszcenciáját csökkentjük. Az aspecifikus antigán blokkolás BSA oldatban történik, ehhez további 0,1% Triton kerül a sejtmembrán permeabilitásának növelése érdekében. A primer oldatok 2 napon keresztül, 4 °C-on, rázógépen inkubálódnak a metszeteken, az inkubáló oldatba 2-3 primer antitest kerül. Ezek specificitását, a szükséges koncentrációt a fentiekben részletezett módon ellenőrizzük. A megfelelő szekunder antitestek kísérletsorozattól függően 1 napig 4 °C-on vagy 3 óráig szobahőmérsékleten, sötétben inkubálódnak. Ezt követően a metszeteket Schnell et al. 1999 alapján pH=5 3 mmol/l réz-szulfátot, 50 mmol/l ammónium-acetát tartalmazó desztillált vizes oldatban 40 percig tartjuk, ezzel csökkentve azok autofluoreszcenciáját. A metszeteket ezt követően lefedjük. A metszeteket a labor Nikon Ci-L mikroszkópjával, vagy a Fénymikroszkóp Centrumban elérhető konfokális rendszerekben (Nikon A1R, C2) és 3DHistech tárgylemez szkennerekben vizsgáljuk.
3. ábra: SMI32-immunfestett (zöld) humán óriás piramissejt (Betz-sejt) és egy szomszédos parvalbumin (PV)-immunopozitív (piros) interneuron (nagy nyíl) nagy nagyítású konfokális képe. A kis nyilak PV-pozitív periszomatikus terminálisokat jelölnek.