Mintavétel emberi agyból

Mintavétel

Post mortem 

A kontroll idegszövetet a Lenhossék program illetve Tatabányai Szent Borbála kórház bocsájtotta rendelkezésünkre. Olyan elhunytakból származik, akiknek neurológiai megbetegedése nem volt. A kontroll személyek életkora 27 és 102 év között változott. A boncolást a Semmelweiss Egyetem Igazságügyi Kórbonctani Intézetében és a Szent Borbála Kórház Patológiai osztályán hajtották végre, az Egészségügyi Minisztérium és a Helsinki Deklaráció rendelkezéseinek megtartásával. A post mortem idő a vizsgálatba bevont kontroll idegszövet esetében 2-5 óra volt, kivéve amikor a hosszú post mortem idő hatását vizsgáltuk, akkor 8-10 órás mintákat használtunk.

A kontroll idegszövet mellett szkizofréniával élő, és súlyos neurokognitív károsodában szenvedő alanyok idegszövet mintáit gyűjtjük. A szkizofréniás alanyok a DSM-III-R és a BNO-10 klasszifikációs rendszerek szerint lettek diagnosztizálva, a neurokognitív károsodás vizsgálatában a BNO-10 rendszerben demencia diagnózist kapott alanyok vannak bent. Az alanyok általános neuropatológiai jellemzése is megtörténik utólag. A kérgi mintákat a post mortem alanyokból Brodmann területek szerint mintázzuk. 

Epilepsziás minták

Az epilepsziás idegszövetet terápiarezisztens temporális lebeny epilepsziában szenvedő betegek műtétileg eltávolított hippocampusa (elülső egyharmad) képezte, az FCD betegekből frontális, parietális és occipitális régióból származó agykérgi mintát kaptunk. A vizsgálatokat a Kutatásetikai Bizottság rendelkezéseinek megtartásával (TUKEB 5-1/1996, kiterjesztve 2005, 2011, új engedély 2019) végeztük. A betegek egy írásos beleegyező nyilatkozat adtak a műtét előtt, hogy tudományos célokra felhasználható az eltávolításra került szövet. A rohamok fókuszát video-EEG monitorozás, MRI SPECT és/vagy PET segítségével határozták meg, és standard anterior temporális lobectomiával (Spencer and Spencer 1985) távolították el a temporális lebeny anterior egyharmadát a temporomediális struktúrákkal együtt. Az összehasonlító és kvantitatív  vizsgálatokhoz a hippocampus ugyanazon anterio-posterior kiterjedéséből származó régiót használtuk fel. Kihagytuk a kvantitatív vizsgálatokból a tumor-asszociált epilepsziában szenvedő betegek adatait. 

Fixálás

A sebészi eltávolítás után a hippocampust/kérget 4-5 mm széles blokkokra vágjuk, és 4% paraformaldehidet, 0.05% glutáraldehidet és 0.2% pikrinsavat tartalmazó 0.1M foszfát puffer (PB) alapú fixáló oldatba helyezzük (pH=7,2-7,4). Az agyszövetet fixáló oldatban rázógépre helyezzük, a fixálót 6 órán keresztül, minden félórában friss oldatra cseréljük, majd a blokkokat egy éjszakán keresztül ugyanabban a fixáló oldatban, de glutáraldehid nélkül utófixáljuk (Magloczky et al., 1997). A kontroll agyat ugyanennek a fixálási folyamatnak vetjük alá, vagy a halál beállta után 2-4 órával a koponyából kiszedve, a két-két arteria carotis internán, illetve vertebralison keresztül perfundáljuk, először fiziológiás sóoldattal, majd fixáló oldattal, amely 4% paraformaldehidet és 0,2% pikrinsavat tartalmazott 0,1M PBben. A hippocampust/kérget ezek után kivesszük, 4-5 mm vastagságú blokkokra vágjuk, melyeket ugyanabban a fixáló oldatban, de glutáraldehid nélkül utófixáljuk egy éjszakán át, 4 °C-on. A blokkokból vibratómmal 60 mm vastag szeleteket vágunk, és egymást követő foszfát PB mosásokkal távolítjuk el a nem kötött fixálót, majd a metszeteket 30 % szacharóz oldatba helyeztük 1-2 napra. A krioprotektív oldatban a metszeteket 3-szor megfagyasztjuk fólia csónakban folyékony nitrogén fölött, és vagy eltartalékoljuk későbbi kísérletek céljára -80 °C fok-on, vagy immunfestjük.