BAC alapú transzgenezis

A bakteriális mesterséges kromoszómák (BAC) a plazmidokhoz hasonló cirkuláris DNS konstrukciók, melyek ún. fertility faktor (F-plazmid) eredetűek. A BAC vektoron található speciális gének biztosítják, hogy a kópiaszám alacsony marad (1-2 kópia/sejt), és ez lehetővé teszi, hogy a konstrukció stabil maradjon nagy, akár 300 kb méretű  genomiális inszert hordozása esetén is. A nagyobb méret lehetővé teszi, hogy egy teljes gén környezetét és az ott található cisz regulációs régiókat (enhanszerek, represszorok, inzulátorok stb.) felhasználhassuk egy transzgén kifejeztetésére. Ennek köszönhetően egy BAC alapú konstrukcióval kifejeztetett transzgén precízebben képes másolni a cél endogén gén expresszióját, és az sokkal kevésbé lesz kitett a pozíció hatásnak, azaz a véletlenszerű integrációból adódó expressziós szint változásoknak.

A BAC alapú transzgenezis legnagyobb hátránya, hogy a transzgenikus konstrukció előállítása idő- és munkaigényes, és a mikroinjektálás során az integrációs

hatékonyság alacsony. A BAC a nagy mérete miatt nem módosítható hagyományos, rekombináns DNS technológiákon alapuló eljárásokkal, hanem különböző homológ rekombináción alapuló stratégiákat dolgoztak ki, amiket összefoglalóan ‚recombineering’-nek („recombination-mediated genetic engineering”) neveznek. Ezekben az eljárásokban az a közös, hogy először egy BAC módosító plazmid konstrukció készül el, ami tartalmazza a transzgén összes szükséges komponensét, általában a promóter és a regulációs régiókon kívül, amiket majd a BAC hordoz. A BAC módosító kazetta elejéhez és végéhez kapcsolják a homológ rekombinációs karokat (5’ és 3’ karok), amelyekkel bázispár pontossággal meg lehet határozni, hogy a módosítás hol történjen a BAC-on, azaz hová épüljön be a transzgén kódoló régiója. A rekombináció a baktériumsejtben zajlik le a sejtben megtermeltetett rekombináz enzimek segítségével, és különböző szelekciós lépések biztosítják a megfelelő klón kiválasztását. 

A BAC alapú transzgenikus konstrukciókat alap esetben lineáris formában, pronukleáris mikroinjektálással juttatják be embriókba, ahol véletlenszerűen integrálódnak a plazmidoknál kisebb valószínűséggel.

Újabban lehetőség van rá, hogy a BAC-okat kombináljuk egyéb technológiákkal:

-A transzpozázok képesek a BAC méretének megfelelő DNS-t is integrálni a genomba jó hatásfokkal, de ez a beépülés még mindig véletlenszerű.

-Az integrázok segítségével adott, ún. safe harbor lokuszokba építhetjük be a BAC konstrukciót