Integrázok és helyspecifikus transzgenezis

A hagyományos transzgenezis két főbb problémája az alacsony integrációs hatásfok és a véletlenszerű beépülésből fakadó pozició hatás, azaz az integrációs környezet hatása a transzgén expressziójára.

Ezeket a problémákat küszöbölhetjük ki az integrázok alkalmazásával. Csoportunk a bakterifág eredetű BxB1, szerin típusú integrázt használja, amire jellemző, hogy egyirányú rekombinációt tud előidézni az egyedi felismerőszekvenciái között (attB és attP helyek). A rekombináció eredményeképpen egy cirkuláris molekula, amely az attP helyet hordozza be tud épülni a genomban található attB ún. dokkoló helyre teljes egésézben. A rekombináció során kialakulnak az attL és attR helyek, amelyeket már nem ismer fel az enzim, így a folyamat egyirányúnak tekinthető (szemben a jellemzően reverzibilis módon működő tirozin integrázokkal, mint amilyen pl. a Cre rekombináz).

A dokkolóhelyek kialakítása célzott genommódosítással történik, a CRISPR/CAS technológia segítségével illesztjük az attB helyeket olyan régiókba, amely irodalmi adatok alapján transzkripcionálisan aktív, de nem okoz problémát semmilyen endogén génben. Az általunk is használt lokuszok: gtRosa, Tigre, Polr2a.

A BxB1 integráz felismerőhelyeinek is léteznek variánsai pl. attB-P(GA), attB-P(GT), amelyek a típuson belül kizárólagos rekombinációt tesznek lehetővé. A megfelelő felismerőszekvenciákat alkalmazva elérhető, hogy ne a teljes transzgenikus konstrukció integrálódjon, hanem kazettacsere történjen, így pl. a konstrukció vektor elemei nem integrálódnak. Az ilyen rendszerhez természetesen szükséges, hogy a dokkoló régió mindkét fajta attB szekvenciát hordozza.

A transzgenikus konstrukció vektor részét más stratégiával is eltávolíthatjuk, ilyenek az 'önkivágó' vektoraink, melyek a Dre rekombinázt fejezik ki, és egyúttal ennek az enzimnek a felismerőhelyeivel (rox helyek) határolják a vektor régiót. A Dre kódoló régiója intronnal megszakított, így baktérium sejtben biztosan nem tud kifejeződni.

Az integráz mediált transzgenezis is kombinálható a mesterséges bakteriális kromoszómákkal. Ehhez egy másodlagos BAC módosítás szükséges, amely során a BAC vektorba illesztjük a BxB1 integráz attP felismerőhelyét. 

Egy tipikus BxB1 integráz alapú transzgenikus konstrukció, jelen esetben a kcnrg cDNS kifejezésére, amely  alap helyzetben meg van fordítva és a Cre rekombináz jelenlétében áll helyre az expresszió. A vektor az ún. önkivágó típusú.