Immuncitokémia és élősejtes képalkotás
Az endokannabinoid-rendszer működésének és funkciójának tanulmányozására számos sejtkultúra-preparátumot használunk, valamint különböző konstrukciókat expresszálunk ezekben a sejtekben
Gyakran használunk primer hippokampusz-kultúrákat, amelyeket P1-es egerekből állítunk elő. A sejteket papain emésztés után csiszolt üvegpipettákkal történő triturációval disszociáljuk, és poli-D-lizin bevonatú üveg fedőlapokra vagy üvegfenekű Petri-csészékre ültetjük egy ESCO Labculture lamináris doboz alatt. A tenyészeteket 37°C-on és 5% CO2 -on tartjuk Thermo Forma inkubátorban, B-27 és 2 mM L-glutaminnal kiegészített Neurobasal A táptalajban. A plazmid DNS-sel történő transzfekciókat Lipofectamine 2000 segítségével végezzük. Az organotípusos hippokampusz szeletkultúrákat P6 egerek vibratomos szeleteiből készítjük, és tenyészlemezbetéteken tartjuk fenn 50% MEM, 25% HBSS, 25% NHS, 30 mM glükóz, 1 mM Glutamax-I és penicillin-streptomicin tartalmú táptalajban.
A fluoreszcensen jelölt fehérjéket expresszáló élő kultúrákat vagy az immuncitokémiával festett, fixált mintákat a Nikon A1R konfokális rendszerrel Ti-E inverz mikroszkópon vesszük fel. Az élősejtes képalkotás stabil körülményeinek fenntartása érdekében a mikroszkópot hőmérséklet- és CO2-szabályozóval, valamint egy perfúziós kamrával is felszereltük. A stabil, hosszú távú képalkotást a NIKON Perfect Focus rendszer is támogatja. A rendszer piezo z-állványt és rezonáns szkennert is tartalmaz a gyors képkészítési sebesség érdekében, valamint egy 32 csatornás spektrális detektort a közeli emissziós spektrumú jelek elkülönítéséhez. Az objektívek közül egy 1,4 NA 60x CFI Plan Apochromat VC 1,4 NA 60x olajimmersziós objektív áll rendelkezésre a nagy felbontású képalkotáshoz széles spektrumtartományban. A 3D képhalmazok helyreállításához az SVI Huygens de-convolution szoftverét használjuk. A képelemzés az ImageJ, az Adobe Photoshop, a Huygens és a NIS elements szoftverekkel történik.