Molekuláris klónozás és fehérjevizsgálatok
Kutatásaink középpontjában az endokannabinoid rendszer különböző molekuláris szereplőinek és más lipid jelátviteli útvonalaknak idegrendszeri működése áll.
Kutatási kérdéseink megválaszolásához genetikai konstrukciók átfogó könyvtárát hoztuk létre, amely lehetővé teszi számunkra, hogy korrelatív kísérleteket (pl. HA-, SEP-, AcGFP- vagy mCherry-jelölt fehérjékkel) és perturbációs kísérleteket (pl. funkciónyeréses vagy funkcióvesztéses modellekkel) végezzünk a minket érdeklő génekkel. Ennélfogva a laboratórium jól felszerelt az összes standard molekuláris neurobiológiai technikához, amelyek minden projektünk szempontjából döntő fontosságúak. DNS-konstrukciókat kapunk alkalmanként kollégáktól és kereskedelmi forrásokból, de rendszeresen készítünk plazmidokat a laboratóriumban is. Ezt úgy érjük el, hogy először teljes RNS-t tisztítunk az agyszövetből, reverz transzkripcióval cDNS-re írjuk át, majd hagyományos PCR segítségével elegendő DNS-t nyerünk a plazmidok előállításához. A laboratóriumban több genetikailag módosított egértörzset is fenntartunk (jelenleg >10 vonal), ezért a PCR gépeket rendszeresen használjuk genotipizálási reakciókhoz.
A legtöbb hagyományos bakteriális rendszert használjuk klónozáshoz, és az így kapott plazmidokat agaróz gélen restrikciós enzimekkel történő emésztéssel vagy polimeráz láncreakciókkal elemezzük, és felhasználás előtt mindig szekvenáljuk. Az E. coli heterológ fehérje-expressziós rendszert is használjuk a GST-jelölt epitópok tisztítására az antitestek előállításához. Az expresszált fehérjéket hagyományos SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel lehet elemezni. A GST-címkéket trombin segítségével levágjuk az epitópról, és nyulakba vagy KO egerekbe injektáljuk a kívánt antiszérák előállításához (ez utóbbi lépést a budapesti Eötvös Loránd Tudományegyetem Immunológiai Tanszékén Prof. Kacskovics Imrével és az Immunogenes AG-val együttműködve végezzük). Az immunizálást követően az affinitással tisztított antitesteket először Western blot-on elemezzük, majd vad típusú és knock-out állatokból származó agyi metszeteken immunhisztokémiával igazoljuk. Minden publikált konstrukciónk és antitestünk kérésre szabadon hozzáférhető az élettudományi közösség számára.