Immunhisztokémia

Az immunperoxidázos megközelítést elsősorban érzékenysége és stabilitása miatt alkalmazzuk. A választott kromogén a 3,3′-diaminobenzidin (DAB). Ezt a megközelítést egy adott fehérje regionális eloszlásának fénymikroszkópos szintű feltárására optimalizáltuk, de kihasználható a szubcelluláris eloszlás feltárására elektronmikroszkópos szinten is. A fénymikroszkópos elemzéshez a központi idegrendszer meghatározott régióiról egy Nikon Eclipse 80i függőleges mikroszkóp segítségével és egy Nikon DS-Fi1 digitális színes kamerával készítünk felvételt.

Az immunfluoreszcenciát rendszeresen használjuk arra a célra, hogy egynél több fehérje sejtszintű kifejeződési mintázatát mutassuk ki ugyanabban a mintában. Nikon Eclipse 80i függőleges mikroszkópunk epi-fluoreszcens tartozékkal van felszerelve, amely FITC, Texas Red, DAPI és Cy5 szűrőkockákat, valamint egy Nikon Super High Pressure Mercury lámpát tartalmaz. A részletes elemzés nagy részét azonban a Nikon A1R konfokális rendszerrel végezzük, amely egy Nikon Ti-E fordított mikroszkópon alapul. Ez 4 lézerrel van felszerelve, amelyek 405, 458, 488, 514, 561, 641 nm-es lézervonalakat biztosítanak, valamint egy 32 csatornás spektrális detektorral, ami nagymértékben növeli rugalmasságunkat a többszínű festési kísérletek kialakításában. Figyelemre méltó, hogy a legújabb technológiai fejlesztések azt is lehetővé teszik, hogy szubcelluláris szinten több célpontot is vizsgálhassunk.

Végül, az immunogold jelölési technológiával adott fehérjék pontos szubcelluláris helyzetét nanométeres skálán tárjuk fel. A fixált agyi metszetekben lévő célfehérjéket 0,8 nm-es aranyrészecskékhez konjugált antitestek kötik meg, amelyeket ezüst intenzifikációs módszerrel tovább fokoznak. Az immunfestett metszetek OsO₄ -os és uranil-acetátos kezelés után etanol és acetonitril növekvő sorozatában dehidratáljuk, és Durcupanba ágyazzuk. Az érdekes területeket újra beágyazzuk és újból metszünk. A 20-60 nm vastagságú ultravékony metszetek elektronmikroszkópos elemzését Formvar bevonatú egynyílású rácsokon végezzük Hitachi 7100 elektronmikroszkóp segítségével. Az elektronmikroszkópos felvételeket 1 000-100 000-szeres nagyítással készítjük.