Egy módszertani cikk a JBC-ben

Nobel-díjat nem csak nagy felfedezésekért, új távlatokat nyitó elméletekért, de a kutatásokat segítő vagy lehetővé tevő eszközök, módszerek kidolgozásáért is lehet kapni. Igaz, ehhez néha nagy adag szerencse és hosszú élet is kell. Az első elektronmikroszkópot 1931-ben Max Knoll-lal együtt megépítő Ernst Ruska nem csak Aaron Klug Nobel-díját érte meg 1982-ben, melyet a nukleinsav-fehérje komplexek szerkezetének tanulmányozásában is fontos krisztallográfiai elektronmikroszkópia kifejlesztéséért nyert el, de 1986-ban végre átvehette a sajátját is. Igaz, nem egyedül, hanem Gerd Binnig és Heinrich Rohrer társaságában, akik kerek ötven évvel az övé után, 1981-ben építették meg a díjat érő pásztázó alagútmikroszkópot. 

A nagy fontosságú, mára alapvetőnek tekintett módszerek felfedezői, kidolgozói közül is idézhetnénk neveket, és hogy épp az angol Frederik Sangerét említjük, annak két igen nyomós oka van. Két Nobel-díj.

Egészen 2022-ig  Sanger volt az egyetlen, aki kétszer is kémiai Nobel-díjban részesült. (A klikk-kémia egyik megalkotójaként K. Barry Sharpless a másik, aki 2022-ben nyerte második Nobel-díját.) Ez az igen szerény, magát és teljesítményét soha túl nem becsülő kutató - aki a nyugdíjkorhatárt elérve másnaptól már csak a kertjével foglalkozott, átengedve laboratóriumát a fiatalabbaknak - 1943-és 55 között igen szorgalmasan és soha el nem csüggedve dolgozott, míg sikerült meghatároznia az inzulinmolekulát felépítő aminosavak sorrendjét. Ez magában is szép teljesítmény, valódi világrekord volt, de a legnagyobb jótétemény mégis az, hogy módszere más fehérjék elsődleges szerkezetének meghatározására is alkalmas. Megérdemelten vette át 1958-ban első Nobel-díját. Akkorra már korának nagy és divatos kutatási témáján, a kettős spirálú DNS szerkezetének megfejtésén dolgozott. A DNS-t felépítő nukleotidok sorrendjének megfejtése jóval nehezebb, bonyolultabb feladat volt, de a következetes, jól átgondolt munka és kitartás itt is meghozta gyümölcsét, és egy bakteriofág DNS szerkezetének megfejtéséért 1980-ban ismét átvehetett egy kémiai Nobel-díjat. (A díj fele Paul Berget illette, azért az általa kidogozott technológiáért, amely lehetővé tette az első rekombináns DNS létrehozását, Walter Gilbert pedig a díj másik felén osztozott vele saját módszerének kidolgozásáért, mellyel kisebb DNS-ek szerkezetét lehetett aránylag gyorsan meghatározni.)

A nukleinsavak másik csoportját az RNS-ek alkotják.  Míg sejtjeink minden sejtmaggal rendelkező sejtje ugyanazt a DNS-t tartalmazza, kifejeződő RNS sokféle van, és sejttől-területtől is függ, miféle. Ezt a sokféleséget szó szerint kell érteni! Az úgynevezett transzkriptom, az egy adott sejtben-szervezetben termelt RNS-átiratok teljes készlete, olyan nagy és bonyolult, hogy csak nagy áteresztőképességű módszerekkel érdemes tanulmányozni. Az utóbbi időkben alkalmazott, az eddigieknél jóval nagyobb pontosságot és nagyobb dinamikatartományt biztosító újgenerációs szekvenálási eljárások létrejöttében pedig kulcsszerepe volt egy szintén kémiai Nobel-díjat érő felfedezésnek, a PCR-nek, azaz polimeráz láncreakciónak (Kary B. Mullis, 1993).

Hrabovszky Erik csoportjának munkája neurokémiailag és anatómiai elhelyezkedés tekintetében is definiált idegsejttípusok transzkriptomikai jellemzését teszi lehetővé. Cikkük a majd 120 éves, elismertségét mindmáig megőrző Journal of Biological Chemistry-ben (JBC) jelent meg, mely bár nem tartozik az idegtudományokra szakosodó folyóiratok közé, mindig törekedett arra, hogy a biológiai kémia - biokémia mellett fóruma lehessen a kapcsolódó tudományágaknak is, így segítve a biológiai folyamatok molekuláris és sejtszintű alapjainak feltárását.

Munkájukról Hrabovszky Erikkel, a csoport vezetőjével beszéltünk.

 - Gratulálunk a Rumpler Éva és Göcz Balázs megosztott elsőszerzőségével megjelent közleményetekhez! Mi az, amit nem szakértőként is érdemes tudni róla?

- Egy sokrétűen felhasználható metodikát részletesen leíró közleményről van szó, melyben számos, a módszer optimalizálása során kapott részeredményt is közreadunk.

A “LCM-Seq” (laser capture microdissection - sequencing) alkalmazása során a génmódosított állatokból a ZsGreen világító fehérjét kifejező idegsejteket LCM módszerrel, egy tetszőlegesen kiválasztott agyterületről összegyűjtjük, azokból RNS-t izolálunk, cDNS könyvtárat készítünk, majd az idegsejttípus teljes transzkriptomjának feltárására új generációs szekvenálást végzünk.

- Az LCM rövidítéssel jelzett módszerről, mivel a lézerek nem csak szemműtétek esetében történő alkalmazása már néhány évtized óta bevett gyakorlattá vált, könnyű elhinni, hogy segítségével megoldható egyes sejteket-sejtcsoportokat mikroszkóp alatt adott területekről kivágni és tisztán összegyűjteni. A cDNS-könyvtár egy reverz transzkripciónak nevezett eljárással készülő átirat az általatok összegyűjtött sejtekből izolált mRNS-ből.  De mennyiben jelent előrelépést a Ti módszeretek a korábban már létező szekvenálási módszerekhez képest?

- A mienk is besorolható a számos, igen eltérő stratégiát használó spatial transcriptomics (térbeli transzkriptomika) módszertanok közé. A térbeli információ megtartását, azt, hogy pontosan meghatározott helyekről származik a szekvenálásra kerülő minta, a szövettani metszetekből elvégzett, LCM alapú sejtizolálás biztosítja.

- És mi biztosítja azt, hogy eredményetek sejttípusra is megbízható legyen?

- A sejttípusokra jellemző transzkriptom igen érzékeny kimutatását több száz azonos helyről kigyűjtött, "poolozott" (összeadott) idegsejt használatával értük el. Mintegy 15 000 különböző transzkriptum azonosítása válik így lehetővé, ami meghaladja a különböző ún. egysejt RNS szekvenálási (scRNA-Seq) módszerek érzékenységét, melyek általában sejtenként 3-4000 különböző RNS detektálására alkalmasak. Természetesen ezek a módszerek is rendelkeznek egyedi előnyökkel.

- Ezerszer több RNS-izolátumot használtok. Ez miért fontos?

- A ritka transzkriptumok kimutatását is biztosító nagy érzékenységen kívül, egy további igen lényeges előny is származik abból, hogy a szekvenálás nanogramm nagyságrendű RNS izolátumból indul ki, szemben az egysejt szekvenálási módszerek pikogrammos nagyságrendjével. A nagyobb kiindulási RNS mennyiség az egyes RNS molekulák megbízható kvantifikálását is elősegíti. Erre egy példát is bemutatunk a cikkben. Modellként két kolinerg sejttípus transzkriptomikai összevetésével 2800 szignifikáns eltérést mutattunk ki két agyterület, a mediális szeptum és a striátum kolinerg sejttípusai között.

- Igazán meggyőző módszeretek érzékenysége és alkalmassága kvantitatív vizsgálatokra. Milyen típusú kérdések megválaszolására lesz alkalmazható, illetve hol van szükség ilyen nagyfokú megbízhatóságra, pontosságra?

- Elvben minden olyan neuronrendszer transzkriptomja elemezhető ezzel a megközelítéssel, melyben egy fluoreszcens transzgén fehérje terméke a sejtek mikroszkópos azonosításához elegendő intenzitású jelet biztosít.

Arra, milyen esetben szükséges ilyen pontosság, tavalyi cikkünket idézhetem (Göcz és mtsai., PNAS), melyben petefészek-irtott, majd ösztrogénnel vagy vivőanyaggal kezelt egerek kisspeptin idegsejtjeinek transzkriptomját hasonlítottuk össze. Az említett módszertani precizitás itt ~2300 ösztrogénfüggő gén megbízható azonosítását tette lehetővé. A módszer szisztematikus optimalizálását a mostani módszertani cikk egyes kísérleteiben végeztük el.

- Már akkor is kiváló eredményt adott, de még finomítottatok rajta. Miért volt erre szükség?

- A fluoreszcens jelek megőrzése formalinnal történő szövettani fixálást igényel, miközben az újgenerációs szekvenáláshoz a fixálatlan szövetek biztosítják a cDNS könyvtárkészítéshez szükséges RNS legjobb megőrzését. Tesztek alapján választottuk ki az optimális fluoreszcens jelzőanyagot (markert), a formalin koncentrációját, az izolálandó neuronok ideális számát, valamint az RNS izoláláshoz és a könyvtárkészítéshez használt technológiákat, kereskedelemben kapható kiteket. Göcz Balázs és Takács Szabolcs a munka során komoly bioinformatikai jártasságra is szert tettek, ami megkönnyíti a laboratóriumunkban folyó, hasonló elven alapuló transzkriptomikai projektek jövőbeli kivitelezését.

- Foglalkoztok-e a módszertan további fejlesztésével, és ha igen, mi a fejlesztések iránya?

- A fluoreszcens neuronok JBC cikkben leírt LCM-Seq vizsgálatakor génmódosított egérmodellt használtunk. Ez olyan korlátot jelent, amelytől sikerült a közelmúltban megszabadulni. Ma már formalinnal fixált szövetek immunhisztokémiával azonosított idegsejtjeit is vizsgálni tudjuk!

- Akkor régebbi mintákat is vizsgálni tudtok! Ez nagyszerű. És mi lesz a legizgalmasabb?

- A legizgalmasabb kutatási terület természetesen az egyes emberi idegsejt típusok transzkriptomjának feltárása lesz post mortem szövettani mintákból. Több peptiderg sejttípus esetén ez a törekvésünk már sikerrel járt.