A COVID és a mikroglia

A legutóbbi, sok millió áldozatot szedő világjárvány egy sok tekintetben megváltozott világot hagyott maga után. Igen sajnálatos és veszedelmes is, hogy csak kevesen vannak, akik nem felejtették el a járvány tanulságait, mert az emberek többsége bizony ismét védtelen lenne egy hasonló kihívással szemben.  Szerencsére vannak olyanok, akik nem felejtették el, mi hogyan történt, és ma is tesznek azért, hogy ne álljunk majd védtelenül hasonló helyzetek előtt. Egy ilyen kutatásról és eredményeiről beszélgettünk a Nature Neuroscience cikk első szerzőjével, Fekete Rebeka posztdoktorral, a kutatást irányító Dénes Ádám csoportjának tagjával.

 - Egy Nature folyóiratban közlésre elfogadott munka esetében egyáltalán nem ritkaság, hogy az 7-10 éves kutatási idő eredményeit összegzi. A ti munkátok kezdetét azonban kérdezni sem nagyon kell, hiszen nem lehetett 2020 előtt!

- Pontosan ekkor, 2020-ban kezdtük el COVID-projektünket, és laborunk a világon az elsők között kapott hivatalos engedélyt COVID19-ben elhunyt betegek boncolására. 

- Ez szinte vakmerőségig bátor, és mindenképpen tiszteletreméltó vállalás volt. Egy éven át még vakcina sem volt, a halálozások száma pedig néhol szinte exponenciálisan nőtt!

- Az országban egyetlen neuropatológus, Hortobágyi Tibor vállalta azt a kockázatot, hogy elvégezze a boncolásokat, kézi vezérléssel, az akkor rendelkezésre álló védőfelszereléssel – és igen, kezdetben még a védőoltások sem voltak elérhetők. 

A járvány erősödésével pedig még azzal a kihívással is szembe kellett néznünk, hogy a korlátozások egyre bonyolultabbá tették a logisztikát.

- Mire utalsz ezzel?

-  A minták begyűjtése sok nehézséggel járó folyamat volt, s ennek megszervezésében nagy segítségünkre voltak az Országos Korányi Pulmonológiai Intézet patológiájának munkatársai. A feladat már csak amiatt is rendkívüli rugalmasságot követelt, mert a boncolások időpontját nem lehetett előre tervezni. Volt, hogy hajnali 3-kor kaptam a hívást, hogy új minták érkeznek, és azonnal készen kellett állnunk azok fogadására. 

- Járványügyi kutatásokban résztvevők különösen jól értik, miért volt alapvető szükség a mintagyűjtésre, és azt is, mit jelent hasonló helyzetben, szó szerint életveszélyes körülmények között napról-napra és hosszú hónapokon keresztül helyt állni. De hogyan, miért kezdett csoportotok, mely az agy immunsejtjével, a mikrogliával kapcsolatos eredményeivel szerzett nemzetközi hírnevet, ezekbe a Covid-kutatásokba?

- A járvány térhódításával egyre több hír érkezett arról, hogy a COVID19-et túlélő betegek körében gyakoribbá váltak a neurológiai problémák, például a stroke. Ezért napi szinten figyeltük a legfrissebb kutatásokat, hogy megértsük, milyen változások zajlanak az agyban, és milyen összefüggésekre derült fény más laborokban.

- Ennek eredményeként meg tudtatok fogalmazni egy kérdést, melyre választ akartatok kapni?

- Kutatásunk nem egyetlen, előre meghatározott kérdés köré épült, hanem inkább egy folyamatosan formálódó folyamat volt. Kezdetben az alapvető kérdések – például hogyan hat a COVID19 az idegrendszerre – adták meg a projekt alapját, de ahogy haladtunk előre, új kihívások és érdekes eredmények jöttek felszínre, amelyek mind egy-egy új irányt sugalltak. 

- Mit vizsgáltatok először?

- Azt, milyen gyulladásos és neuropatológiai változásokat mutatnak a COVID19 által érintett agyi struktúrák. Ahogy egyre több adatot gyűjtöttünk és elemeztünk, sorban fogalmazódtak meg az adott pillanatban legfontosabb kérdések.

Egy dologban hamar biztosak lettünk. Mivel egyre gyakrabban kaptunk a klinikusoktól visszajelzést agyi gyulladásra, így egyértelműnek látszott, hogy a mikroglia is vélhetően érintett lehet a vírusfertőzés szövődményeinek kialakulásában. 

Itt kezdtük el a kutatást. 

- Eddig elért eredményeitekre gondolva, azért volt már mire építenetek!

 - Korábbi munkáink megadták az alaphangot, valóban nem volt kérdés, mit is nézzünk meg először. Így indultunk el a mikroglia morfológiai változásainak vizsgálata, majd a mikrogliális P2Y12 receptorszint változásának vizsgálata felé. Az induláskor összegyűjtendő alapinformációk közé tartozott az is, hogy megtaláljuk a leginkább érintett agyterületeket. 

Ekkorra már azt is tudni lehetett, hogy a vírus főleg légzési és keringési problémákat okoz, így ezeket az agyterületeket priorizáltuk.

- Milyen vizsgálatok céljára gyűjtöttetek szöveti mintákat?

- Már a mintagyűjtést megelőzően fontosnak tartottuk, hogy ne csak hisztológiai/anatómiai eredményeink legyenek, hanem fehérje és RNS szintű mechanizmusokra is fényt derítsünk. Ennek alapján terveztük meg a mintagyűjtési protokollunkat is. Ez úttörő módszer volt, mely a megszokott patológiai protokolltól lényegesen eltért, de ez tette lehetővé, hogy egymással párhuzamosan több módszerrel kaphattunk eredményeket az anatómiai és funkcionális szempontból is összehasonlítható tükörblokkjainkból. Így tudtuk hisztológiai vizsgálódásainkkal párhuzamosan elindítani a tükörblokkokból a különböző gyulladásos faktorok és a SARS-CoV-2 vírus RNS meghatározását.

- Nagy ötlet volt, őszinte elismerésem!

- Fontos kezdeti lépés volt a vírus detektálása is. Az addig ismert publikációk eredményei semmi olyan adatot nem tartalmaztak, ami bármilyen hisztológiai validálást nyújtott volna, nem tudtuk, milyen is egy vírusra validált festés. Az irodalomban kizárólag qPCR-es vizsgálati eredmények álltak rendelkezésünkre, amiből még azt sem tudtuk biztosan, hogy a vírus melyik sejttípusban bújik meg az agyban. Számos antitest tesztelés és protokoll finomítás után találtuk meg azt az egy antitestet, amivel biztosan meg tudtuk jelölni a SARS-CoV-2 nukleokapszid fehérjéjét. Miután ezt az eredményt tüdőszöveten sikerült validálnunk/hitelestenünk, tudtuk csak elkezdeni az agyban való kutakodást.

- Mi részed volt ezekben az induláshoz létfontosságú kísérletekben, és mit tartasz legnagyobb hozzájárulásodnak az eredményekhez?

- A kutatásban való részvételem nem a protokoll kidolgozásával kezdődött, hiszen az egész mintagyűjtés során szerepet vállaltam. Emellett a Korányi kórház betegeitől is rendszeresen gyűjtöttem vérplazma mintákat. Az első két évben én dolgoztam fel az összes szöveti blokkot, ami magában foglalta az adminisztrációt, beágyazást, metszést, festést, a mikroszkópos vizsgálatokat és a hisztológiai analízist. 

- Akkor nemhogy munkanélkülinek nem érezhetted magad, de egyetlen napodat sem mondhattad sem unalmasnak, sem veszélytelennek!

 - Mi több, tanulnom is kellett, mivel a mintákat számos speciális tudást igénylő módszerrel is vizsgáltuk! Ehhez rengeteg szakmai segítséget és támogatást kaptam Cserép Csabától, Szabadits Esztertől és Schwarz Anettől, akik a csoportunkban az elektronmikroszkópia, az elektron-tomográfia és STED mikroszkópos módszer szakértői. 

- Emellett??

- Feladatom volt még a COVID19-es esetek laboradatainak és patológiai zárójelentésének gondos vizsgálata, hogy felismerhessük, ha bármilyen korreláció van az agyi gyulladás és a klinikai labor adatai között. 

- Ez sem lehetett könnyű munka, különösen, hogy az elhunytak egészségügyi háttere a COVID19-et megelőzően sokféle volt.

- Ezzel párhuzamosan megkezdtem a molekuláris biológiai vizsgálatokhoz szükséges fagyasztott minták feldolgozását, amelyek az áramlási (flow) citometriás és qPCR-analízisek alapjául szolgáltak. 

- Egyedül??? 

- A rengeteg szövet és vérminta feldolgozásában és mérésében segítséget kaptam Tóth Krisztinától. Intézetünkön belül pedig külön köszönjük Acsády Lászlónak és Dávid Csabának a talamus agyterülethez érintő specifikus kérdések tisztázását. 

- Ha már a köszönetnyilvánításoknál tartunk, kik vettek részt a munkában más intézetekből? 

- A munkát jelentős részt vállalt Benkő Szilvi és Bíró Eduárd (Debreceni Egyetem), akik nem csak a qPCR mérések technikai lebonyolításával, hanem a gyulladásos folyamatok hátterében álló mintázatfelismerő receptorok azonosításával is nagy segítségünkre voltak. 

A kutatás sikeréhez a mesterséges intelligencia alkalmazása is hozzájárult, ezért Csikász-Nagy Attilának, Fichó Erzsébetnek és Szalma Jánosnak tartozunk köszönettel. Arthur Liesz és Alba Simats (Institute for Stroke and Dementia Research, Munich) pedig a projekt nemzetközi kollaborációs partnerei voltak.

 - Egy ekkora munka jó megszervezése külön tehetséget igényel – szerintem. Mi volt a Te tapasztalatod?

- A legnagyobb kihívás számomra az volt, hogy viszonylag hirtelen csöppentem bele egy komplex humán kutatásba, ahol teljesen más szemléletre és munkamódszerekre volt szükség, mint amit addig az egér alapú kutatásokban alkalmaztam, ahol, ha egy mérés nem sikerült, volt lehetőségünk újabb állatokat bevonni. Itt minden egyes szövetblokk egyedi és megismételhetetlen volt, óriási felelősséggel dolgoztunk, ami szakmai szempontból is kihívást jelentett, és állandóan klinikusokkal kellett kommunikálni. De elkészített szövetbankunk egyedülálló, és számos további kutatási kérdést tudunk megválaszolni belőle.

- Ez a szövetbank maga is óriási eredmény!

-  COVID19 szövetbankunk önmagában is különleges, mert amíg egy klinikai kutatásban nagy elemszámra építenek, hasonló feldolgozottsági szintű esetek ritkán elérhetők. Ez ellensúlyozza azt a tényt, hogy nem rendelkezhettünk százas nagyságrendű mintákkal, ami például vérminták esetében nem jelent problémát. 

Meglepő volt, hogy a kis elemszám ellenére, erős összefüggéseket találtunk a rendelkezésünkre álló mindössze 13 COVID19-es esetében az agyi gyulladás és a perifériás gyulladásos folyamatok között.

 - Volt valami megemlítendő nehézség a minták beszerzésében?

- A COVID19-es esetek mellé természetesen kontroll mintákat is gyűjtenünk kellett, és ez a járvány alatt rendkívül lassan haladt. Emiatt alternatív forrásokat is fel kellett használnunk. Ebben nagyon nagy segítségünkre volt intézetünk Maglóczky Zsófia vezette HAL (Humán Agy Laboratórium) csoportja, Palkovits Miklós professzor úr agybankja, és egy holland agybank. Ezeket hasonlítottuk össze a COVID-esetek mintáival, és tudtuk leírni a megfigyelt változásokat. 

 - Mit éreztél a legnehezebbnek a Nature Neuroscience cikk megírásában?

 - Követelmény volt, hogy az eredményeket pontosan és mélyrehatóan mutassuk be, de eközben a tudományos közösség számára érthető és világos összefoglalót is kellett adnunk. Emellett meg kellett felelnünk a szigorú módszertani és statisztikai követelményeknek, valamint hitelesen kellett átadnunk a kutatás komplexitását is.

- Ahogy a kísérletek, módszerek, adatok sokáságát láttam, a komplexitás átadása lehetett a legkisebb gond… De komolyra fordítva a szót, a megírásban sem voltál egyedül!

- Távolról sem! Ez a projekt nem valósulhatott volna meg Dénes Ádám nélkül, aki az egész kutatási folyamatot kézben tartotta, és a cikk írásában is oroszlánrészt vállalt. Nagyon hálás vagyok továbbá Cserép Csabának és Pósfai Balázsnak, akik az adatfeldolgozásban, az ábrák szerkesztésében és a cikk megírásában nyújtottak hatalmas szakmai segítséget. Az ő alaposságuk és elkötelezettségük kulcsszerepet játszott abban, hogy a végeredmény ilyen magas színvonalú lett. Nagyon köszönöm a közös munkát!

-  Végezetül hadd kérjem még, hogy a nem szakértők számára is, foglald össze egy mondatba, szerinted mi ennek a nagy és nagyszerű munkának legfőbb eredménye és jelentősége!

- Munkánk során olyan mechanizmusokat térképeztünk fel, melyeknek jobb megértése amellett, hogy a jövőben lehetőséget adhat a hosszú-COVID szindrómával együtt élő emberek életminőségének javítására, más neurodegeneratív betegség alaposabb megértését is szolgálja. 

Ábra: a. COVID19-ben elhunyt beteg agyszövetében, az erek mellett található mikroglia sejtek elveszítik P2Y12 receptoraikat, amelyek kulcsfontosságúak az erekkel és idegsejtekkal való kommmunikáció során. b. Ér melletti Iba1-pozitív mikroglia sejt 3 dimenziós modellje, amint bekebelez egy SARS-CoV-2 fertőzött immunsejtet (magenta). c. Sérült szinapszisok (sárga) a mikroglia sejt fagoszómában. d. Mielinhüvely sérülését mutató szuperrezolúciós mikroszkópiás felvétel.