Az agy szerkezetvizsgálatának egy fontos lépése kimaradt az #agytechnikák rovatból. Ráadásul az első. Írtunk a festésekről a mikroszkopizálásról, de arról nem hogyan jutunk hozzá a biológiai mintákhoz.
Minap jelent meg egy hír a KOKI honlapján, hogy két fiatal kutatónk a HUN-REN ARP tudományos „nagykövete” lett. A hír kifejti mit is jelent ez és beszélget a kutatókkal. Erre nagyon jól rímel, hogy az #agytechnikák rovatban a tudományos együttműködés egyik nagyon fontos új módjáról írjak: az adatok mindenki által elérhető, jól szervezett formában való megosztásáról.
Az alapelvek után nézzük meg most, milyen klasszikus és modern típusai vannak az elektronmikroszkópoknak. A két klasszikus a TEM (transzmissziós, azaz átvilágító EM) és a SEM (szkenning, letapogató EM). Mindkettő megfelelően előkészített mintát igényel a képalkotáshoz. A TEM hasonlóan egy klasszikus fénymikroszkóphoz egy vékony metszetet „világít” meg elektronokkal.
Ugyan az # agyséta a szerveződési szinteken felfelé halad, mi itt most az #agytechnikák rovatban kicsit lefelé a sejtektől a sejtalkotórészek felé haladunk. Eddig a fénymikroszkópokról volt szó, most egy szinttel lejjebb lépünk. Bemutatjuk az elektronmikroszkópok fajtáit és hogy melyik mit mutat meg nekünk.
Egy fontos gondolat, hogy az idegsejt populációk aktivitásának időbeli változását leíró trajektóriákat számunkra nem mérhető erők alakítják. Ha azonban megfigyelünk sok trajektóriát, következtethetünk a hálózat viselkedését formáló erőkre, a hálózat dinamikájára (az aktvitás fejlődésére).
Ha a sejtek szétválogatásával megvagyunk következik a második elemzési fázis. Igazából az egész dolog lényege. Megpróbáljuk sejtjeink tüzeléséből és tüzeléseik összefüggéséből kibogarászni mit és hogyan kódolnak. Itt két megközelítés alapján dolgoznak a kutatók: az egyes sejtek működésének oldaláról (single neuron approach) és a sejtcsoportok működésének oldaláról (population approach).
Elnézést, hogy sokat kellett várni erre a bejegyzésre. Afféle vihar előtti csend volt, mert az elkövetkezőkben néhány elvont matematikai struktúrával kell majd megbirkózni az adatelemzés kapcsán. Időbe tellett, mire emészthetővé rágtam a mondandómat.
Eddig a jelek gyűjtéséről volt szó. Sok csatornáról sok jelet lehet gyűjteni. Egy kis számolással utána lehet járni mennyit is.
Amikor áttekintettük az elektrofiziológiai módszerek szivárványát, valahol középtájt (a koponyatetőről elvezetett EEG és az egyedi ioncsatornákból elvezetett áramok között) szó volt a sokelektródás mező elvezetésekről (local field potential recording). Itt ugye vékony elektródákat juttatunk az agyszövetbe az idegsejtek közé és a sejtek által a külvilágba leadott áramokat csípjük el.
Két nemrég megjelent tudományos cikk magyarázatához következik egy kis technikai alapozás. A két cikkben az a közös, hogy mindkettő a Rózsa Balázs vezette Neuronhálózat és Dentritikus Aktivitás Kutatócsoport laboratóriumban készült és saját fejlesztésű, az agyi aktivitás vizsgálatában úttörő technikai újításokat használó 2-foton mikroszkópokat használt.
Az előzőekben bemutattuk, hogy elő lehet állítani olyan transzgénikus egereket, melyek bizonyos sejtjeikben, azok egy jól meghatározott részén vagy egy meghatározott időben, különböző szintetikus fehérjéket fejeznek ki. Ily módon megjelölhetünk sejteket, fény hatására serkenteni vagy gátolni tudjuk őket, illetve megfigyelhetjük a sejtek működését.
De miért jobb fényt használni, mint az elektromosságot arra, hogy a sejtek aktivitását vizsgáljuk és befolyásoljuk?
Az #agyseta rovat háttérbe szorult mostanában, de szükség van további technikai alapozásra egy hamarosan bemutatandó cikkhez. Hogy adjunk egy barackot a virtuális élménynek, ma az agykutatók fegyvertárának egyik legújabb és legnagyobb ágyúját mutatom be, az Optogenetikai módszereket.
Egy idegsejt ~20000 szinapszison keresztül kap jeleket, melyeket a dendritjein folyó elektromos áramokká alakítja. Az idegsejtekben a jelösszegzés során ezen kívül még további ionáramok alakulnak ki, melyek a jelerősítésben vagy ha szükséges jelgyengítésben, finomításban játszanak szerepet.
A hálózatok duruzsolásának kihallgatására alkalmas módszerek után, ma az egyedi idegsejt viselkedését vizsgáló elektrofiziológiai módszerek kerülnek sorra. A következő lépés az úgynevezett juxtacelluláris elvezetés. Juxta = közeli, azaz a sejtek közvetlen közeléből vezetünk el egy vékony üvegkapillárissal (~0.5µm).
Ugyan az anatómia fegyvertárából az elektronmikroszkópokat még nem tárgyaltuk, de a változatosság kedvéért kóstoljunk bele az élettan módszereibe is. Mivel az idegsejtek elektromos jeleket használnak, az agyműködés meghatározó kutatómódszere az elektrofiziológia. Bemelegítésként tehát vegyük is át, hogy milyen módszerek használ, és melyikkel mit tudhatunk meg az agyműködésről?
A legutóbb az igáslovaknál hagytuk abba, igaz a fluoreszcens mikroszkóp, már doppingoltnak számít. Hasonló képpel élve ma a táltosokkal és a hétfejű sárkányokkal ismerkedünk. Már csak azért is, mert ezek a mikroszkópok áruk miatt saját istállókban, intézeti műszerközpontokban laknak, ahol számos kutatócsoport használják azokat, eben szakemberek segítik a kutatókat. Intézetünkben is van egy ilyen műszerközpont, ahol számos megtalálható az alanti mikroszkópok közül. Segítségükkel számos kiemelkedő közlemény született mely az idegsejtek jelátviteli folyamataiban szerepet játszó molekulák pontos elhelyezkedését és kölcsönhatásait mutatta ki.
Van ám a pályajelölésnek egy harmadik módja is: a transzneuronális jelölés, azaz amikor a jelölés nem áll meg egy idegsejtnél, hanem annak célsejtjeit is megjelöli a szinapszisokon keresztül hatolva. Ezzel a módszerrel egész kapcsolat láncolatokat lehet feltérképezni. Igazából már a Waller féle axonelvágásos módszer is tudott így működni. Ugyanis, ha egy idegsejt elveszti bemeneteinek nagy részét akkor elpusztul és kisvártatva azok az idegsejtek is elpusztulnak, akiknek első sejtünk küldte volna az ingerületet (ha nem kaptak máshonnan számottevő bemenetet). Tehát ha van egy pályánk, ami meghatározó bemenete egy rendszernek akkor így az egész rendszer felépítése követhető, ha egyre későbbi időpontokban megnézzük hol tart a pusztulás az agyban.
Az anatómusok arzenáljának egy eddig nem említett fontos elemei a különböző kapcsolat és pályakövető eljárások. Ugye, mint korábban vázoltuk egy rendszer megértésében az elemek lajstromozása után a következő lépés az az, hogy melyik elem melyikkel van összekötve. A kapcsolatok lehetnek helyi kapcsolatok különböző sejtek között, illetve távoli kapcsolatok agyterületek között. Az egy adott területen található idegsejtek helyi kapcsolatainak kvalitatív (leíró jellegű, milyen típusok léteznek) és kvantitatív (megszámoló, melyikből mennyi van) felderítésére más módszereket használnak, mint az agyterületeket összekötő pályák, vetítések vizsgálatára.
Viszonylag sokat kellett várnotok a mai bejegyzésre, de az #agyhirek rovatban egy olyan frissen megjelent cikket mutatunk majd be, ami komolyabb felvezetést igényel.
A biológia most ért a részecskegyorsítók korába. A biológusok és közöttük az agykutatók kísérleti rendszerei -bár nem olyan drágák és bonyolultak, mint a CERNben a Higgs-bozon megjósolt létezését bizonyító LHC - de hatalmas mennyiségű információt termelnek. Ebből az adathalmazból az adatbányászat fizikusok, matematikusok által kifejlesztett módszereivel új típusú összefüggéseket és összefüggés hálózatokat lehet kibogozni. Ezeket a módszereket leglátványosabban a genetikai szabályozórendszerek és az agyműködés vizsgálatára használják.
Intézetünk kutatói e két tudományterület metszetében dolgozva jelentős eredményt mutattak fel a PNAS folyóiratban, mely az Amerikai Tudományos Akadémia presztízses kiadványa. Hogy érthető legyen a munka jelentősége szükség van egy kis technikai alapozásra.
Az előzőbejegyzésben bemutaott technikák jellemezték a neuroanatómiát az 1980-2000es években. Jelentős továbblépést a jóminőségű, elérhető fluoreszcens mikroszkópok megjelenése és az ezzel járó fluoreszcens festék fejlesztés jelentette. Mi is az a fluoreszcens festék és miért fontos? A fluoreszcenciajelensége nevét a fluorit ásványról kapta, melyet az emberi szem számára nem látható (bár azt károsító) UV (ultraibolya) fénnyel megvilágítva az kékes-lilán világít, azaz a spektrum (szivárvány, színskála) egy általunk nem látott tartományában ráeső fényt elnyelve egy általunk látható fényt bocsájt ki. A fluoreszcencia során, tehát egy megfelelő hullámhoszúságú fénnyel megvilágított molekula azt elnyeli, majd gyakorlatilag azonnal egy alacsonyabb, jól meghatározott hullámhosszúságú fényt bocsájt ki. Amikor a fénykibocsájtás nem azonnali, hanem elnyújtott akkor beszélünk foszforeszcenciáról.
A mikroszkópok palettáját már röviden bemutattuk, most kicsit alaposabban vesszük végig melyik mire is való és hogyan kell megfesten a mintákat használatukhoz.
A klasszikus fénymikroszkóp az anatómus laborok igáslova. Minden laborban van több is. Hiszen az anatómusi munka számos fázisában szükséges, hogy alaposabban megnézzük azt a pici dolgot, amivel dolgozunk. Ahhoz, hogy az agyszövetet festeni és vizsgálni lehessen szükséges abból 30-150 µm (mikrométer, a méter egymilliomod része) vastagságú (ez inkább vékony) metszeteket készíteni. Egyrészt, hogy a festéshez használt anyagok be tudjanak diffundálni a metszet teljes mélységébe, másrészt, hogy a fény jelentősebb szóródás nélkül áthatoljon a metszeten és a mikroszkópban éles képet kapjunk.
A Forma 1 egyre gyorsabb és kevesebbet fogyasztó autóit a mérnökök által kidolgozott új megoldások hajtják előre. Hasonlóan, az agykutatás nagy áttöréseit módszertani újdonságok alapozzák meg.
Ahogy azt a „Mi az az idegtudomány?” és a szerveződési szintek-ről szóló bejegyzésekben bemutattuk, az agyat eltérő irányokból vizsgáló kutatók kérdéseik megválaszolására egyedi módszereket használnak. Az egyes vizsgálati módszerek az agy szerkezetének és működésének elemzését különböző térbeli és időbeli léptékben teszik lehetővé.
Az anatómusok fegyvertárának másik rekesze a Képalkotás. Ahhoz, hogy sejtszinten lássuk hova kötődtek a festékjeink látnunk is kell őket. Erre a sokféle mikroszkópia valamelyikét használjuk.
A legkorábbi. Levenhoek által feltalált, egyszerű fénymikroszkóp, ahol a mintát megvilágítjuk vagy átvilágítjuk erős fehér fénnyel és egy lencserendszerrel felnagyított képet kapunk.
Mint azt a Porszívó szétszerelésénél megtudtuk az anatómus a rögzített, mozdulatlan, halott rendszert vizsgálja, hogy meg tudja milyen elemekből áll a rendszere, ezekből mennyi van, mik a lehetséges kapcsolatok és melyik kapcsolatból mennyi van.
Az agyat alkotó sejtek kicsik (a sejtek központjának a sejttestnek az átmérője 20-30 mikrométer, azaz a méter milliomod vagy a milliméter ezred részéből kell 20at venni). Az őket összekötő nyúlványrendszer ágainak vastagsága (0.3-2 mikrométer) és a közöttük levő szinapszisok (150 nanométer) még kisebbek. A sejteket felépítő fehérjék még ennél is apróbbak. Neo a Mátrixban azt mondta: „I want guns! Lots of guns!”. Az agykutató anatómus azt mondja: „Mikroszkópokat akarok! Sok mikroszkópot!”
Ez az #agytechnikák rovat bemelegítő bejegyzése. Ahhoz, hogy segítsük a más szálakon bemutatott eredmények megértését, ezen a szálon bemutatjuk majd az agykutatásban használt modern módszereket. A bejegyzés áttekinti a kérdéseket és hogy melyikre milyen módszerrel lehet válaszolni.
