Egy újabb lépés az emberi hippokampusz és betegségei megismeréséhez

A hippokampusz vizsgálata intézetünknek egyik fő és sikeres projektje már vagy három évtizede óta. Ez volt a kutatási területe az első Agy-díjjal 2013-ban kitüntetett Buzsáki Györgynek, Freund Tamásnak (ma az MTA elnöke, akkor igazgatónk) és Somogyi Péternek, teljes kutatómunkáját a hippokampusznak szentelte John O’Keefe, aki tanítványaival, May-Britt és Edvard Moserrel közösen 2014-ben orvostudományi Nobel-díjat nyert. Hosszan lehetne sorolni jelentős felfedezéseket – de ezek elsősorban nem az emberi hippokampuszra vonatkoznak. Ez pedig annál is inkább fontos lenne, mert az agyműködés, és kiemelten is a hippokampusz idegi hálózatainak felépítését, működését számítógépes modellek, mesterséges intelligencia alkalmazása csak akkor segítheti, ha megbízható alapadatok állnak rendelkezésre. Ezt pedig épp az emberi agy esetében eddig nem mondhattuk el. 

Kérdéseinkre, kezdve azzal, mi volt az oka ennek a “lemaradásnak” és mi tette épp most lehetővé és aktuálissá azokat az alapvető jelentőségű és hiánypótló vizsgálatokat, melyek a Journal of Neuroscience folyóirat szerkesztőinek elismerését is kiérdemelték, Takács Virág, a cikk egyik első szerzője, Nyiri Gábor csoportjának szenior kutatója válaszol.  

- Azzal kell kezdjem, hogy a vizsgálataink tárgyát képező interneuronok morfológiájáról, elhelyezkedéséről és különböző neurológiai betegségekben bekövetkező változásairól már számos tanulmány született emberi mintákon is. Ugyanakkor teljes számuk pontos becslésére eddig még nem került sor. 

- Ez hogyan fordulhatott elő?

- Ennek több oka is van, melyek közül az egyik legfontosabb talán az, hogy az ilyen vizsgálatokhoz szükséges kiváló minőségű immunfestés kizárólag rövid, saját vizsgálataink esetében legfeljebb 3 és fél órával a halál beállta utáni („post mortem”) és megfelelően perfundált minták esetében kivitelezhető. A másik, hogy sztereológiai vizsgálatok szigorúan betartandó szabályai megkívánják a szisztematikus sztereológiai mintavételt, ehhez pedig elengedhetetlen, hogy a teljes hippokampusz szöveti megőrzöttsége, azaz fixáltsága, egyenletesen jó legyen. Ezt a kemény feltételt általában nehéz teljesíteni.

- Nektek mégis sikerült!

- Hálásak is vagyunk érte, különösen a KOKI-ból Maglóczky Zsófiának és a Humán Agyszövet Laboratóriumnak, valamint a tatabányai Szent Borbála Kórház patológusainak, elsősorban Dr. Gombás Péternek! Nekik köszönhetően, végül négy kiváló minőségű mintát sikerült feldolgoznunk.

- Gondolom, a munka nehézségei és kihívásai ezzel nem értek véget. . .

- A kutatás egyik további kihívása a feladat munkaigénye volt. A teljes hippokampuszokat le kellett metszeni, ezután a mintavételezett metszeteket software segítségével kirajzolni.  Egyedül a sejtszámoláshoz 94 metszetre volt szükségünk, és továbbiak kellettek a térfogatméréshez. Előfordult, hogy egyetlen metszeten csak a sejtek bejelölése egy teljes napot vett igénybe. Az elektronmikroszkópos adatok előállítása során az összes hippokampális régió összes rétegéből (összesen 15 réteg), több különböző mintából és immunfestésből festésből ágyaztunk át mintákat, amelyekből sorozatmetszeteket készítettünk. A pásztázó elektronmikroszkóppal készült metszetsorozatokból (egyetlen sorozat több, mint 50 metszetet jelent) nagy területen, háromdimenziós rekonstrukcióval jelenítettük meg az immunjelölt axonvégződéseket. Mindez rengeteg munkaórát igényelt.

- Még egy hozzá nem értő számára is rengeteg munkának tűnik. Hogyan szerveztétek meg a folyamatot?

- Megosztottuk a feladatokat. A fénymikroszkópos rajzolás legnagyobb részét négyen végeztük: Papp Peti, Zsoldos Tamás, Zichó Krisztián és én, az elektronmikroszkópos munkán Bardóczi Zsuzsival ketten dolgoztunk, míg az adatok kiértékelésében elsősorban Orosz Áron, Papp Peti és én vettünk részt.

- Mi határozta meg azt, hogyan, milyen adatokat és milyen formában kell gyűjteni, hogy alaklmasak legyenek a számítógépes modellek létrehozásához? 

- Ezt a projektet az Európai Unió Human Brain Project keretében vállaltuk, így a kezdetektől pontosan tudtuk, milyen adatokat és milyen formában kell megadnunk. A különböző gátló neuronok és szinapszisok teljes száma alrégiónként és rétegenként, alapvető információ egy anatómiailag pontos hálózati modell létrehozásához. Az összes nyers adatot a cikk kiegészítő táblázataiban közöltük, és bízunk benne, hogy ezek hamarosan beépülnek a legújabb modellekbe.

- Mostanában készült számítógépes emberi hippokampusz modell?

- Gandolfi és munkatársai 2023-ban közölték emberi hippokampusz CA1 régiójáról készült modelljüket. A szerzők humán adatok hiányában nagyrészt rágcsáló interneuronokra kapott értékekre támaszkodtak, az ismert emberi piramissejtszámhoz skálázva azokat. 

- Eredményeitek alapján mi a véleményed, mennyire sikerült megközelíteniük a valóságot?

-  Jelentős eltérést találtunk az ember és rágcsáló fajok között a három fő gátlósejtcsoport, a parvalbumin, szomatosztatin és kalretinin tartalmú interneuronok arányában! Például, amíg patkányokban a legnagyobb csoportot a parvalbuminpozitív interneuronok alkotják, emberi mintáinkban ötször annyi kalretininpozitív sejtet találtunk, mint parvalbuminpozitív interneuront. Ez is arra utal, hogy az eddigi modellek finomhangolása elengedhetetlen, és adataink hozzájárulhatnak egy pontosabb, ember-specifikus hálózati reprezentáció kialakításához.

 - Le a kalappal bátor vállalkozásotok és elvégzett munkátok nagysága előtt is, de a kapott értékek, a teljes sejtszám, illetve az összes gátló szinapszis száma, nem abszolút, hanem becsült értékek. Mi akadályozta a pontos szám meghatározását, és ez a becsült érték mennyire közelítheti a valóságot?

 - A hippokampusz mérete önmagában is óriási egyéni varianciát mutat, így a sejtszámokban is természetesen jelentős eltérések tapasztalhatók. Mivel az említett korlátok miatt mindössze négy alany hippokampuszát tudtuk elemezni, adatsorunk elsősorban egy első, közelítő becslésként értelmezhető.

 - Hatalmas munkátok során a hippokampuszoknak mekkora hányadát vizsgáltátok részletesen teljes térfogatukhoz képest, és minek alapján lehet azt állítani, hogy a kapott adatok pontosak?

- A sztereológiai szabályokat követve, a teljes szöveti térfogatnak átlagosan körülbelül a tizedét használtuk fel különböző vizsgálati célokra. Azt, hogy további mintavétel nem befolyásolná jelentősen az adatok pontosságát, külön mintával, statisztikailag is ellenőriztük. A fennmaradó metszetek pedig lefagyasztva várják a jövőbeli projekteket. 

 - Mekkora humán hippokampusz mintákat kaptatok?

- A teljes hippokampuszokat megkaptuk, és vibratómmal lemetszettük. Ezt követően szisztematikusan, sok helyről vettünk mintát. Erre azért is szükség volt, mivel a hippokampuszt hosszanti tengelye mentén némileg eltérő kapcsolatok és funkciók jellemzik, így a különböző sejttípusok sűrűsége sem feltétlenül azonos egész térfogatában.

- Miért nem lehetett a szövetet átlátszóvá tenni, elkerülve a metszések miatti szövetvesztést, és így végezni el a jelölést?

- Bár a szövet átlátszóvá tétele alternatív megközelítés lehetett volna, humán post mortem minták esetében ennek megvalósítása több szempont miatt sem lett volna praktikus. A tisztítás a sejt-azonosító fehérjék egy részét is kimossa, az antitestek teljes szöveti penetrációja szinte lehetetlen volna, és az emberi sejtekben felhalmozódó lipofuscin nevű pigment granulumok autofluoreszcenciája miatt olyan magas lenne az immunfestések háttere, hogy megnehezítené a specifikus jelölés detektálását. Ezért a hagyományos metszet-alapú módszert és a jelölés fénymikroszkópos detektálását választottuk. 

- Volt-e olyan munkafázis, eljárás, amit a kísérletek során szerzett tapasztalatok alapján módosítottatok? 

- Az első mintánál észrevettük, hogy az immunfestés minősége romlik, ha a szöveti blokkokat hosszabb ideig (hetekig) azidos foszfátpufferben tároljuk. Ezért a későbbiekben igyekeztünk minél hamarabb lemetszeni a teljes hippokampuszokat, és a mélyhűtőből elővett, 30%-os szacharózban tárolt metszeteket használtuk a kísérletekhez.

Felfigyeltünk arra is, hogy a parvalbuminnal festett sejttestek esetében elképzelhető, hogy mesterséges intelligencia alkalmazása, azaz automatikus detektálás is működhetne a tárgylemez-beolvasóval (slide-scanner) készült képeken. Ez azonban nem használható a szomatosztatin- és kalretinin-metszet-pásztázóvalek estében, mivel ezek festése sokszor halvány.

Jelenleg egy szinapszis detektáló szoftver fejlesztését kezdtük el, amit elektronmikroszkópos vizsgálatainkhoz szeretnénk majd használni. 

- Nagyon sok mindent megtudhattunk kísérleteitek technikai hátteréről, a leküzdött nehézségekről, de a korlátokról is. Bizonyára nem véletlenül választottátok vizsgálataitokhoz a parvalbumin, a szomatosztatin és kalretinin interneuronokat. Milyen neurológiai/pszichiátriai betegségekben játszanak fontos szerepet, és mit gondolsz, egy, az új adatok segítségével épült modell milyen kérdésre adhat leghamarabb választ? 

- Ismert, hogy a parvalbumin-pozitív hippokampális interneuronok sűrűsége skizofréniában csökken, Maglóczky Zsófia csoportja pedig azt mutatta ki, hogy epilepsziás betegek esetében kevesebb a kalretinin-expresszáló interneuron. Állatkísérletek arra utalnak, hogy a szomatosztatin-pozitív interneuronok működési zavara is szerepet játszhat az epilepszia által kiváltott hálózati változásokban. E két utóbbi interneuron típus különösen érzékeny az érelzáródásra, és több adat utal arra is, hogy az Alzheimer-kór eltérő módon érintheti az egyes interneuron populációkat. 

Ahhoz, hogy jobban megértsük csak az előbbi, rövid felsorolásban említett betegségek kialakulását és mechanizmusait is, anatómiailag pontos modellre van szükség, melyek valósághű, emberi interneuron-adatokra épülnek. Munkánk ehhez járult hozzá.