Miért jó, ha megismerjük a transzkriptomot? Egy módszer fontosságáról és az elért eredmény hasznáról

A kísérletekben alkalmazott módszerek kiválasztása minden munkának meghatározó eleme. „A módszer minden” („Die Methode ist alles”), mondta Karl Ludwig, a XIX. századi neves német fiziológusa, akit 1872-ben az MTA is tagjának választott, de száz évvel később világhírű idegtudósunk, Szentágothai János, egykori MTA elnökünk is kiemelte a kutatásban alkalmazott módszerek fontosságát. Meggyőződése szerint megbízható tudományos eredményeket csak szilárd alapokon álló módszerekkel lehet elérni, és az innovatív technikák a megismerés nélkülözhetetlen eszközei olyan tudományterületeken, mint a neurobiológia.  Valószínű, hogy örömmel nyugtázta volna azt a módszerfejlesztést is, melyet bármely faj idegsejtjeinek azonosítására és teljes RNS készletének meghatározására dolgozott ki a Hrabovszky Erik vezette kutatócsoport. 

- Mi az a transzkriptom, és miért éppen az agy gonadotropin-felszabadító hormon (GnRH) tartalmú idegsejtjeit vizsgáltátok?

Rumpler Évi 

- A szervezetet felépítő valamennyi sejt ugyanazt a DNS készletet tartalmazza, az egyes sejttípusok különbözősége a DNS-ről átíródó RNS molekulák sokféleségében rejlik. Az egyes sejtcsoportokra jellemző RNS-átiratot nevezzük transzkriptomnak. Ez az RNS-átirat, amellett, hogy függ a sejt típusától és anatómiai elhelyezkedésétől, életünk folyamán állandóan változik.

A kérdés második részére tulajdonképpen már csoportunk neve – Reproduktív neurobiológia – választ ad, hiszen az agy gonadotropin-felszabadító hormon (GnRH) tartalmú idegsejtjei szabályozzák a szaporodási funkciókat. A GnRH peptid ugyanis az agyalapi mirigy GnRH receptoraihoz kötve serkenti az ivarszervekben az ivarsejtképződést és az ivari szteroidhormon termelését szabályozó LH és FSH nevű hormonok felszabadulását. 

- Mióta próbáljátok a GnRH idegsejtekre jellemző RNS készletet, vagyis génkifejeződési profilt megismerni?

- Meglehetősen régóta, ahogy rajtunk kívül még sokan mások is. A korai módszereket a kis áteresztőképesség és alacsony érzékenység jellemezte. A későbbiekben megjelenő chipalapú technikák már sokkal többet elárultak a sejtekre jellemző RNS miliőről, de koránt sem mindent.  

- Tavaly ebben a témában jelent meg egy módszertani cikketek, ugyancsak a JBC-ben!

- Az a cikk mostani kutatásunk szoros előzménye. Az Erik vezetésével kidolgozott, szövettani metszetekből lézeres mikrodisszekcióval (LCM) kinyert idegsejtekből új generációs szekvenálással határoztuk meg az RNS készletet. Ez, az alkalmazott technikák nevének rövidítése alapján „LCM-Seq”-nek elnevezett módszer megbízhatóan működött, de általánosabb alkalmazhatóságának van egy hátránya. Az idegsejtek láthatóvá tétele, mely a lézermikrodisszekció alkalmazásának feltétele, ebben a módszerben még olyan génmódosított egerek használatát követelte meg, melyek fluoreszkáló fehérjét termelnek a vizsgálni kívánt idegsejt típusban. 

- Már maga a génmódosított egérmodell létrehozása is extra idő, és nyilvánvaló, hogy más fajok tanulmányozása nem is lehetséges minden esetben!

- Ezért is kezdtünk el foglalkozni formalinnal fixált szövetek immunhisztokémiával azonosított idegsejtjeinek vizsgálatával. A most kidolgozott módszerrel az egéré mellett a patkány szaporodást irányító GnRH idegsejtjeinek teljes mRNS készletét is sikerült feltárnunk, ami hiánypótló eredmény. A legizgalmasabb talán az, hogy ez a formalin alapú rögzítést használó módszer kisebb változtatásokkal már most alkalmas egyes emberi idegsejttípusok transzkriptomjának feltárására is, post mortem szövettani mintákból. Takács Szabolcs első szerzőségével már csaknem el is készült az emberi idegsejtek vizsgálatára alkalmassá tett technikát leíró kéziratunk!

- Magam is kíváncsian várom az eredményeket, hiszen, ahogy mondani szokás, nem az egerekről és patkányokról akarunk mindent megtudni, és nem is ezeknek a gyógyítása elsődleges célunk.

Most megjelent cikketekben egyfajta idegsejt RNS készletét mutatjátok be egérben és patkányban is. Mit lehet megtudni egy fajról ennek alapján?

- Egy vizsgált sejttípusban egyidejűleg 14000-16000 különböző mRNS-t vagyunk képesek azonosítani és mennyiségileg jellemezni. A nagy számnak köszönhetően a módszer kvantitatív is. Lehetőség van a változó kifejeződést mutató gének azonosítására, és egy adott kísérleti elrendezésben a transzkriptomikai térkép kisebb elmozdulásait is nagy pontossággal ki tudjuk mutatni. 

- Az, hogy egy RNS kimutatható, még nem garantálja, hogy megvalósul a fehérjeszintézis.

Érvényes következtetések vonhatók le az mRNS készlet tanulmányozásából a fehérjeszintekre és a fehérjék működésére vonatkozóan?

- Az eredmény nyilvánvalóan megerősítést, további kísérletek, módszer alkalmazását is igényli. Példának hozhatom egyik mostani eredményünket. A GnRH idegsejtek transzkriptomja magas szinten expresszálta a neurotenzin peptid 2-es típusú receptorát kódoló mRNS-t. A transzkriptom eredmény alapján feltételeztük, hogy a neurotenzin jelentősen befolyásolja a GnRH neuronok működését. Ezt a hipotézist Farkas Imre kollégám elektrofiziológiai vizsgálatokkal alá is támasztotta. 

- Mire lehet még alkalmas a transzkriptomika?

- Kiválóan használható a szabályozó/regulátor RNS-ek vizsgálatára is. Ez egy gyorsan fejlődő, viszonylag új tudományterület. Az ilyen regulátor RNS-ek nem fehérjéket kódolnak, hanem a sejtműködés szabályozásában van fontos szerepük. 

- Módszerfejlesztési kísérleteitek során mi volt a legnagyobb kihívás?

- Az immunhisztokémiai jelölés és a metszetek tárolása során megőrizni az RNS molekulák integritását, valamint megszervezni a kísérleteket.  Szerencsére Göcz Balázs ebben is segített. GYED mellett, részmunkaidőben dolgoztam, így a hét elején elkezdett kísérleteket ő folytatta és fejezte be a hét második felében.

- Hogyan állt össze az az elegy, ami képes volt az RNS megőrzésére, és hogyan zajlottak a próbálkozások?

- Az RNS megőrzésére vonatkozó ötleteket és elképzeléseket szinte már elfeledett, régi szakirodalomból vettük, és labormegbeszéléseken tekintettük át. Volt sok sikertelen próbálkozásunk, de ezeket utólag sem számoltuk össze. Egy biztos: a végleges protokoll kidolgozása hosszú folyamat volt. 

- Egy tudományos folyóiratban megjelent módszernek minden laboratóriumban működnie kell. Mit tudsz tanácsolni azoknak, akik hasonló munkára készülnek? Mire kell leginkább ügyeljenek?

- Talán nem meglepő, ha a precizitásra és a tisztaságra hívom fel a figyelmet. Az RNS kísérletek esetében is csak egy hosszú folyamat végén győződhetünk meg arról, jól dolgoztunk-e. Kiemelendő a protokoll pontos betartása azért is, mert az RNS-t megőrző adalékanyagok koncentrációjának növelése már hátrányosan befolyásolja az immunhisztokémiai jelek kimutathatóságát! 

- Mi okozta a kapott eredmények közül a legnagyobb meglepetést? 

- Egyik, az irodalmi adatoknak ellentmondó megfigyelésünk az volt, hogy az egerek GnRH idegsejtjeiben csak az ösztrogén receptor α-t kódoló Esr1 mRNS, a patkányban pedig csak a ß típusú ösztrogén receptort kódoló Esr2 mRNS fejeződik ki. A két faj között tehát ebben is különbség van, amire kevesen számítottak. A másik hasonlóan fontos megfigyelés a korábban már említett neurotenzin receptor fontos szerepe a GnRH neuronok serkentő szabályozásában. 

- Most közölt eljárásotok az idegsejtek mellett más sejtek transzkriptomjának meghatározására is alkalmas. Van, ami akadályozhatja széles körben való elterjedését?

- Valamelyest korlátozhatja ezt a sejtek izolálására használt lézeres mikrodisszekció (LCM) műszerigénye, továbbá a speciális cDNS-könyvtár készítő készlet borsos ára. Számunkra legfontosabb alkalmazási területe a post mortem humán agyszövetből gyűjtött különböző sejttípusok transzkriptomjának meghatározása, ami jelentősen elősegítheti különböző betegségek kezelésére alkalmas új célpontok azonosítását.

- Jelenleg mit vizsgáltok?

- Többek között a nemi szteroid hormonok génkifejeződésre gyakorolt hatását. Az ösztrogén és androgén hormonok agyi visszacsatolása ugyanis kitüntetett szerepet játszik a szaporodás központi idegrendszeri szabályozásában. Célunk a jelenség hátterében álló molekuláris hatásmechanizmusok pontosabb megismerése. Új módszerünk alkalmazását is tervezzük, hiszen lehetőséget nyújthat a szabályozási folyamatok eddig feltáratlan aspektusainak jobb megértéséhez.