„Transcriptome profiling"

- Gratulálok a Nature Communications cikkhez és első szerzőséghez. Kérlek, mutasd be munkátokat!

- Érdemes talán a mindenki által ismert DNS-sel, pontosabban szólva, a genommal kezdeni, ami az élő szervezet sejtjeinek DNS-ben kódolt örökítő információjának összessége. Az ebből egy adott időpontban átíródó teljes RNS-populáció a transzkriptom. 

Egyetlen DNS-, RNS-szál vagy az ebből lefordítódó fehérjék szerkezetét szekvenálási eljárásokkal határozzák meg. A transzkriptomika a transzkriptom nagy áteresztőképességű vizsgálata egy sejtben/sejttípusban, szövetben vagy szervben.  A nagy áteresztőképességű - más néven új generációs szekvenálás - az utóbbi években terjedt el, és egyszerre sokezer molekula szerkezetének meghatározására képes. 

- Hogyan definiálnod a neuroendokrinológiát?

- A neuroendokrinológia az idegtudományok hatalmas területének egyik ága, mely az idegrendszer és a hormonrendszer kölcsönhatását vizsgálja, beleértve a sokakat érintő, változatos neuroendokrinológiai kórképek, rendellenességek idegi, sőt, molekuláris hátterét is. Ezekről a fontos kutatásokról azonban kevesebbet lehet olvasni-hallani, mint például a neurodegenerációs rendellenességekről vagy mentális betegségekről.

- Csoportotok eredményeit az utóbbi években egymás után jelentetik meg a legjobb endokrinológiai lapok.

Miért esett most a Nature Communications folyóiratra a választás? 

- Ennek a cikknek a témája ugyan neuroendokrinológiai, az általunk fejlesztett módszer azonban sokkal szélesebb körben alkalmazható. Örülünk annak, hogy tanulmányunk olyan folyóiratban jelent meg, amelynek olvasóközönsége túlmutat a neuroendokrinológia szűkebb területén. Reméljük, hogy más kutatók is felhasználják majd az adatokat és magát a módszert. A legjobb folytatás az lenne, ha valamelyik most feltárt molekuláris sajátosság később funkcionális vagy akár farmakológiai jelentőséget kapna.

- El is jutottunk első „igazi” kérdésemhez! Miért kellett módszert fejlesztenetek, és miért van szükség közvetlenül emberi idegsejtek vizsgálatára?

- Még az úgynevezett alapkutatásoknak is meglehetősen ritkán végső célja kísérleti állatok molekuláris szintű megismerése. Korábbi munkáinkból jól ismerünk fajspecifikus sajátosságokat a neuroendokrin szabályozásban, emiatt is fontos azt bemutatni, mi mindenben térnek el az emberi sejtek a rágcsálókban megismert megfelelőiktől!

- Eddig ezt mi akadályozta?

- Nem is egy dolog. Állatkísérletek esetében is igen komoly etikai engedélyeztetési eljárás szükséges ahhoz, hogy egy kísérletsorozat elindulhasson, emberi szövetmintákat pedig leginkább csak adott műtéteknél eltávolított szövetre, és még szigorúbb engedélyeztetési folyamat után szerzett engedéllyel kaphatunk. A mi vizsgálatainkhoz mélyagyi mintákra volt szükségünk, a megfelelő műtéti anyag pedig ezen a területen különösen ritka. 

- Mi volt a legnagyobb akadálya annak, hogy a rágcsálóknál működő, általatok kidolgozott IHC/LCM-Seq nevű szekvenálási eljárásotokat emberi szöveten is alkalmazhassátok?

- Módszerünk lényege, hogy genetikai módosítás nélkül, immunhisztokémiával azonosított fehérje segítségével azonosítjuk és gyűjtjük össze a kiválasztott sejteket, és ezekből nagy mélységű transzkriptomikai profilt készítünk. Ezt a módszert adaptálni, majd validálni kellett a halál beállta utáni (post mortem) emberi szövetre. Nem ment se gyorsan, se könnyen, de végül sikerült. 

Ez a munkafolyamat és a módszer validálása jelent meg most a Nature Communications-ben. 

- Miben tér el a post mortem emberi agyszöveten alkalmazott új eljárás a rágcsálókon alkalmazottól?

-Amellett, hogy optimalizálnunk kellett a fixálás körülményeit, az immunhisztokémiai feldolgozás és a lézeres mikrodisszekció is bonyolultabb, nagyobb kihívás ezeken a mintákon, mint kísérleti állatok szövetei esetében.

-Van az új eljárásban az előzőben nem alkalmazott elem, lépés is?

- Új lépést jelentett az epitóp-feltárás beépítése, amikor a humán metszeteket körülbelül 80 °C-on kezeljük. Meglepő volt, hogy az RNS-védő adalékanyagok ezen a magas hőmérsékleten is hatékonyak maradtak. Amikor a kezelés után is megfelelő minőségű RNS-t tudtunk kinyerni, akkor lett egyértelművé számunkra, hogy az eljárás humán szöveten is működőképes.

- Amikor az eredményeket láttátok-olvastátok, mi volt számotokra a legérdekesebb/legmeglepőbb?

- Leginkább talán a vizsgált sejtek molekuláris repertoárjának gazdagsága lepett meg bennünket. Sokféle neuropeptidet és receptort találtunk, több esetben markáns humán–rágcsáló különbségekkel. Jó példa erre a P-anyag (Substance P) és a CART peptidek eloszlása, amit a transzkriptomikai adatok után a fehérje jelenlétét igazoló immunhisztokémiával is megerősítettünk. A CART például a humán AgRP- és kisspeptin-neuronok egy részében erősen jelen van, miközben rágcsálókban elsősorban a POMC rendszerhez kapcsolódik.

- Mi lehet ezek jelentősége az emberi szervezet, illetve később akár az orvoslás szempontjából? 

- Ha megismerjük, milyen receptorokat és jelátviteli rendszereket használnak például az emberi táplálékfelvételt szabályozó AgRP- és POMC-neuronok, jobban megítélhetjük, milyen hormonális, metabolikus jelek vagy gyógyszerek befolyásolhatják a két sejttípus működését. Munkánk egyik legnagyobb jelentősége a receptorkészlet feltérképezése, mely például az elhízás kezelésére alkalmas, potenciális gyógyszercélpontokat is azonosíthat. Humán adatok szükségesek annak megerősítésére is, hogy állatmodellekben ígéretesnek tűnő mechanizmusok emberben relevánsak-e vagy sem.

Az eredetileg a cukorbetegség kezelésében alkalmazott, de manapság fogyókúrás csodaszerként emlegetett Ozempic hatóanyaga a GLP1 receptorokat serkenti. Ilyen receptort sikerült kimutatnunk mind POMC, mind AgRP idegsejtekben. Emellett számos további receptor is ígéretes jövőbeli stratégia alapja lehet az elhízás elleni küzdelemnek.

- De ezek még mindig alapkutatás során szerzett megfigyelések  . . .

- Valóban. Ráadásul egy receptor RNS-ének jelenléte még nem bizonyítja se annak funkcionális szerepét, se azt, hogy megfelelő gyógyszercélpont lenne. Viszont az adatok további vizsgálatra érdemes jelölteket adhatnak, és segíthetnek egyes állatkísérletes elképzelések újragondolásában. Módszerünkkel több száz, előre azonosított ideg- vagy egyéb - sejt szekvenálásával nagy mélységű profilt készíthetünk, és akár ritka receptorok vagy más molekulák kis mennyiségben jelenlévő transzkriptomát is megbízhatóan kimutathatjuk. 

- Azaz sikerült jelentősen kiszélesítenetek korábbi módszerfejlesztésetek alkalmazhatóságát. Elmaradhatatlan a kérdés: kik vettek részt a munkában?

- A fejlesztést Hrabovszky Erik irányította. A kísérleteket Skrapits Katalinnal, Rumpler Évával és Göcz Balázzsal kezdtük, és elsősorban Katával dolgoztunk tovább a humán alkalmazáson. Sárvári Miklós az RNS-alapú molekuláris munkákat és a szekvenálási könyvtárakat állította össze, a humán mintákat a Semmelweis Egyetem patológusaitól kaptuk, a szekvenálás pedig a debreceni kollégák közreműködésével történt. 

A Nature Communications-től kért kiegészítések is érdemben erősítették a tanulmányt. Biri Dalma és Rumpler Éva immunhisztokémiai vizsgálatokkal, Göblyös Barbara pedig RNAscope-pal igazolt több transzkriptomikai megfigyelést. Ekkor készült a POMC-neuronokról egy régiók szerinti összehasonlítás is.

- Ez a szakasz befejeződött. Hogyan tovább?

- A közölt transzkriptomikai eredmények férfi donorokból származtak. A mostani kísérletekben vizsgált régió kisspeptin idegsejtjei nem csak a reprodukció szabályozásának központi elemei, de a menopauzás hőhullámok kialakulásában is kulcsszerepet játszanak. Reméljük, női donorokból származó mintákon végzendő kísérleteink ezeket a folyamatokat is segítenek majd felderíteni.