Optogenetika: világító gamer egerek távirányítással és idegsejt mozi 2.

Azért, mert az agyszövetben a fény sokka jobban terjed és kevésbé szóródik, mint az elektromos áram. Így az optika évszázados tapasztalatait használva, mikroszkóppal 3Dben, mikrométeres felbontással látjuk az aktív sejteket és ugyanígy pontosan tudjuk irányítani mi az a terület amit fénnyel ingerlünk.
A GFP-vel, vagy annak továbbfejlesztett (érzékenyebb) változatával az EGFP-vel jelölt sejteket akár egy egyszerű fluoreszcens mikroszkóppal is vizsgálhatjuk. Ez a mikroszkóp alkalmas arra is, hogy több más színű fluoreszcens fehérjét tartalmazó sejtet, és azok kapcsolatát is vizsgáljuk egyszerre. Ha a finomabb nyúlványrendszereket (dendrittüske, axon terminálisok) kívánunk vizsgálni akkor érdemes egy konfokális mikroszkópot használni. Mint korábban írtuk, ebben egyrészt javul a felbontás, másrészt nagyobb hatékonysággal gyűjti be a fotonokat, és ezért érzékenyebb is.

Ha azonban a GCaMP-et vagy feszültség érzékeny fehérjéket kifejező sejtek működését szeretnénk vizsgálni akkor árban egy nagyságrendet kell lépnünk (100-150 millió forint egy ilyen szerkezet) és 2 vagy több foton mikroszkópiát használni. Erre két alapvető indokunk van. Egyrészt, mivel az idegi folyamatok gyorsan, ms skáláján zajlanak, igazából mozit kell készíteni a sejtekről, nem fényképet. Ehhez gyors képalkotó rendszerekre van szükség. Másrészt mivel nagyon nagy fényenergiával kell megvilágítani a mintát a 2 foton hatás kiváltásához, egy adott pontban ezt a fókuszált lézerfénnyel nagyon pontosan és nagy sebességgel kell végig pásztázni a mintát, hogy képet is kapjunk és a mintánkat (ami jó esetben él és működik) se süssük meg. Mitöbb, ha a mintánkban egyszerre minél több sejtet szeretnénk vizsgálni akkor nem csak 2D optikai szeleteket kell vágnunk (ez ugye a konfokális és az ebből fejlődő 2-foton mikroszkópia alapműködése), hanem gyors egymás utánban, egymás feletti szeletek 2D pásztázásával egy 3D képet kell alkotnunk. Ez ugye még finomabb, ravaszabb és gyorsabb rendszereket követel, illetve az elkészült képsorozat (video frekvenciával felvett 3D adathalmaz) hatalmas adatmennyiségét még tárolni és számítógéppel feldolgozni is kell. Cserébe egyszerre több száz, több ezer idegsejt működését vagy egy idegsejt egész nyúlványrendszerének jelintegrációját vagyunk képesek megfigyelni. Lélegzetelállító mozikat lehet készíteni arról,

hogyan kapcsolódnak ki és be sejtek populáció az agy működése közben. Igaz cserébe másodpercentként közel 1 GBnyi adatunk keletkezik, amit majd hosszas és bonyolult számításokkal kell elemeznünk, nagy teljesítményű számítógépek segítségével.
Kezdetben ezeket a rendszereket még csak agyszeletek működésének vizsgálatára használták, mert ezeket lehetett a mikroszkópok alá elhelyezni. De manapság már lassan rutinná válik az a technikai bravúr, hogy élő, éber, sőt szabadon mozgó állatok sejtjeinek viselkedését figyelik meg a feladatok megoldásának különböző fázisaiban.

Ehhez két megközelítés alkalmazható. Az egyik a fejrögzített (head-restrained) módszer. Itt egy műtét során egy kis üvegablakot helyeznek el a koponyacsonton, amin keresztül majd belátnak a mikroszkóppal az agyba, illetve az ablak köré egy apró, stabil koronát rögzítenek a koponyacsonthoz, melynek segítségéve az állat fejét elmozdulás mentesen lehet rögzíteni a mikroszkóphoz képest. A műtét után az állat úgy talál folyadékot és táplálékot, ha a fejét behelyezi a koronát rögzítő kütyübe. Néhány nap alatt megtanulja, hogy ez nem okoz kellemetlenséget és jutalmat is kap itt. Ezek után lehet megkezdeni az idegsejtek működésének megfigyelését. De nem ám akárhogy! Mivel az állat feje rögzítve van nem tudna mozogni, ami előnytelen például egy labirintusban való tájékozódás vizsgálatakor. Ezért az egerek alá egy futószalagot vagy egy levegővel alulról lebegtetett labdát helyeznek, ezen szaladgálhat. Mindeközben mindkét szeme előtt egy-egy monitor van (merthogy az egerek szeme oldalra néz, révén zsákmányállatok) melyen virtuális valóságban tájékozódik.

A másik megoldásban az egerek koponyájára egy miniatűr mikroszkópot építenek, mely a szabadon mozgó állatban is képes a sejtek aktivitását mérni. Ennek felbontása persze nem olyan jó, mint az előző rendszeré, de valóságosabb viselkedést enged meg az állatnak.

Akkor most nézzük a másik oldalt, a sejtek aktivitásának befolyásolását. Ugye az agyszeletek esetében viszonylag könnyű a sejteket fénnyel ingerelni, ahhoz, hogy működésüket befolyásoljuk. A legfapadosabb módszer, hogy egy lézerből érkező üvegszál kábel végét a szelet fölé helyezzük, és a lézer kapcsolgatásával tudjuk a sejteket ingerlő vagy gátló fényt bekapcsolni. Jelentősen finomabb megoldás az, amikor a fluoreszcens mikroszkóp fényútjába vetítik be a lézer sugarat, mert ilyenkor egyedi idegsejteket lehet célzottan aktiválni. Így vizsgálható például az, hogy egyetlen sejt be vagy kikapcsolása milyen hatással van a hálózat többi részére. Ennek a technikának a csúcsa, amikor egy lézer projektor mikro-tükör rácsával vetítünk előre tervezett fénypontokat az idegsejtekre. Így tetszőleges kombinációban aktiválhatók sejtek vagy egy sejt dendritnyúlvány rendszere és a hálózat vagy az idegsejtek jelintegrációja vizsgálható nagyon hatékonyan.

Szabadon mozgó állatok esetében is vannak fokozatok. A legegyszerűbb, hogy a műtét során amikor elektródákat ültetünk az állat agyába és vagy a megfelelő vírusokkal fertőzve opszinokat fejeztetünk ki a megfelelő sejtekkel, egy optikai kábel végét is elhelyezzük a megfelelő agyterületen. Ezen az optikai kábelen keresztül jut a sejteket aktiváló vagy kikapcsoló lézerfény a célterületre. Célunk az, hogy megvizsgálhassuk, hogyan változik meg az állat viselkedése, ha megfelelő időpontban ki vagy bekapcsoljuk az adott agyterületet. Mostanra már a vezető újságokban csak úgy jelenik meg egy fontos eredmény, ha a kutatók szabadon mozgó állatban is bizonyítani tudják, hogy az általuk felfedezett mechanizmus vagy agyterület részt vesz az állat viselkedésének alakításában. Az intézetből 2 cikk is jelent meg a közelmúltban a Science folyóiratban, amelyekben a megfelelő agyterület optogenetikai manipulációjával az állat viselkedésének megváltozását érték el. Az egyik munka azt bizonyította, hogy a mediális raphe mag kulcsfontosságú a negatív élmények rögzülésében. Ha a megfelelő pillanatban elhallgattatták ezt az agyterületet az állat nem emlékezett az őt ért traumára. A másik eredmény szerint a nucleus incertus nevezetű agyterület az egyes helyzetekhez társított félelmi memórianyomok rögzítésében fontos.

De szabadon mozgó állatban is használhatjuk egyedi sejtek be vagy kikapcsolására az optogenetikát. A megfelelő opszinokat kifejező sejtek közé egy olyan mikroelektróda sort ültetünk be, ahol a félvezető technikával előállított apró elektródákon az opszinok aktviválásához szüksége hullámhosszúságú lézerfényt kibocsájtó lézer diódát, vagy diódákat helyeznek el a gyártás során. Ezzel a finom eszközzel több tucat sejt aktivitását lehet megfigyelni, miközben egy vagy több sejtet ingerlünk vagy gátolunk optikaikag. Egy ilyen finom szerkentyűn 1-4-8-16 elektróda tű található, mindegyiken 1-8-16 elvezető hellyel és az egyes tüskéken lézerdiódákkal. A tüskék 800-1000 µm hosszúak és 20-100 µm vastagok. Nagyon kell rájuk vigyázni, mert rettentően törékenyek és darabjuk 500-1000 dollárba kerül. Viszont hatalmas mennyiségű információ nyerhető velük az agyi hálózatokban zajló folyamatokról. Megtudhatjuk hogyan kódolják a sejtek a környezet információját és egyes sejtek működésének megváltoztatásával megérhetjük hogyan befolyásolják a hálózat működését.
Az utolsó habcsók a tortán, hogy egy állatban egyszerre kifejezhetjük a sejtek működésének vizsgálatát lehetővé tevő GCaMP-et illetve a sejtek működésének optikai szabályozását lehetővé channel- és halo-rodopszinokat. Így fényt használva egyszerre figyelhetjük meg és befolyásolhatjuk az agy működését. A lehetőségeket csak a képzeletünk határolja be.

Te milyen kérdésre szeretnél választ kapni?

Jó agymozizást!