Hogyan keressük a tűt a genetikai szénakazalban?

A DNS ugye tartalmazza lehetséges génjeinket és ezek szabályozó elemeit. Az RNS-be viszont minden egyes sejt esetében csak azok a gének és egyéb szabályozó elemek íródnak át, amelyek az élőlény adott sejttípusának adott állapotában működnek. Egy sejtben található RNS vizsgálatával tehát pillanatfelvétel készíthető egy meghatározott funkciójú sejtről egy adott pillanatban. Ahhoz lehet hasonlítani, hogy van egy szakácskönyvünk (DNS) amiből barátunk születésnapjára kiválasztjuk kedvenc ételét, kijegyzeteljük egy papírcetlire (RNS), majd a cetli alapján elkészítjük az ételt (fehérje).

Intézetünk munkatársai, Hrabovszky Erik és munkacsoportja, nemrég megjelent cikkében azt vizsgálta, hogy a női ivari ciklus és a termékenység szabályozásában, a pubertásban és a menopauzában fontos szerepet játszó agyi idegsejtekben milyen gének aktiválódnak. A vizsgált sejtek a hypothalamus-ban találhatók. A hypothalamus az agynak az az ősi és életfontosságú része, mely a központi idegrendszer és a test működésének szabályozását hangolja össze. Több alterülete (idegmagja) felelős a hormontermelés szabályozásáért és ezáltal meghatározó a test alapvető homeosztatikus funkcióinak irányításában. Az egyik magjában található kisspeptin tartalmú idegsejtek érzékelik a petefészekben a peteérés körül termelődő ösztrogén mennyiségét és ezáltal részt vesznek a női nemi ciklus (menstruáció-peteérés) szabályozásában. De az élet során az ivari ciklus beindításában (menarche), majd annak leállását követően (menopauza) is fontos élettani szerepük van. Alapvetően meghatározóak tehát a termékenység szabályozásában.
Hrabovszky Erik és munkatársai arra voltak kíváncsiak, hogy a sejtekre ható ösztrogén milyen változásokat okoz a kisspeptin sejtekben, mi változik meg abban, ahogy ezek a sejtek a külvilágot érzékelik, és a nemi ciklus különböző fázisaiban hogyan változik viselkedésük. Mely génjeik aktiválódnak, illetve kapcsolnak ki a nemi ciklus két ellentétes fázisában?
Ha valaminek a változására vagyunk kíváncsiak, akkor meg kell nézni mi-mire változik, azaz kell egy A és egy B állapot, amit összehasonlíthatunk. Ahhoz, hogy a kutatók megnézhessék a sejtek milyen géneket fejeznek ki a ciklus azon részében amikor az ösztrogén szintje alacsony (menstruáció), eltávolították a kísérleti állatok petefészkét, hogy az ne termelhessen ösztrogént. Egy részükben (A csoport) így nézték meg a kisspeptin sejtek RNS készletét, másik részükben (B csoport) pedig egy kis kapszulát ültettek az állat bőre alá melyből a petefészek eredetű ösztrogén hiányának pótlására alkalmas ösztrogén hormon (ösztradiol) szabadult fel, peteérés körüli állapotra jellemző vérszintet eredményezve. Ezután összehasonlították a két RNS mintázatot.

Hogy mindezt megtehessék, a legmodernebb technikai fegyvertárat kellett használniuk.
Az elsőként az egerek kb. másfél centis agyából ki kellett keresniük azt a néhány 10 mikrométer méretű idegmagot (nucleus arcuatus), amiben a kisspeptin sejtek vannak. Ehhez a „laser-dissection” módszert használták. A megfelelő módon elaltatott állatok agyát villámgyorsan lehűtötték, hogy „befagyasszák” a sejtek biokémiai folyamatait és ezáltal megőrizzék az adott pillanatban jelenlevő RNS molekulákat. A fagyasztott agyból vékony, 20 mikrométer vastag szeleteket vágtak. Ezután az egér agyának térképét felhasználva (mert hogy ilyen is van) kikeresték a megfelelő apró agyi magot a hypothalamusban, majd azt egy erre alkalmas mikroszkóp alatt lézerrel körbevágták és egy mintagyűjtő kapszulába gyűjtötték.

A következő lépésben azt vizsgálták meg, hogy a mintákban milyen RNS molekulák és milyen mennyiségben vannak jelen. Ehhez valamennyi RNS molekulát először komplementer DNS-é alakították át reverz transzkripcióval. Itt a klasszikus genetikai információáramlás DNS->RNS irányával ellentétes irányba RNS->DNS másolják az információt egy retrovírusokból származó enzim segítségével. Erre a lépésre azért van szükség, mert a szekvenálás technikai elemei az egyszálú RNSt nem tudják használni, ehhez kettőszálú DNSre van szükség. A kapott DNS szakaszok bázissorendjét nagy áteresztőképességű új generációs szekvenálással derítették fel. Így derült ki, hogy a jelenleg ismert mintegy 56000 transzkript közül 16000 kisspeptin idegsejtekben is előfordul. Ahhoz, hogy ezt a hatalmas adatmennyiséget értelmezni lehessen modern bioinformatikai módszereket használtak: speciális célprogramokat és interneten elérhető genetikai adatbázisokat. A változások hatását a sejtekre a genetikai analízis mellett immunfluoreszcens festéssel és a sejtek aktivitásának elektrofiziológia vizsgálatával is ellenőrizték. Azaz megint felbukkant az a tény, hogy a modern neurobiológiai kutatásokhoz számos diszciplína szakemberének együttműködésére van szükség.

Tehát mit is találtak kollegáink?
Az ösztrogén aktivált kisspeptin sejtekben, az ösztrogén nélküli alapállapothoz képest (ugye A-t hasonlítjuk össze B-vel) a 16000 azonosított elembő 1190 átíródó elem (transcript) szintje nőtt meg és 1139 szintje csökkent. De miért átíródó elemről (RNS-re átírt DNS szakasz) és nem génről beszélek? Eddig mindig csak génekről beszéltem, ez kicsit pongyola volt. Ugyanis a DNSről RNSre nem csak a sejtműködésben szerepet játszó fehérjék információja íródik át, hanem olyan RNSek is melyek transzkripciós faktorokat kódolnak. Ezek olyan fehérjék, amelyek a DNS-hez kötődnek és más gének átíródását szabályozzák (egyszerre több gént is ki vagy bekapcsolhatnak). Ezek fontos résztvevői a genetikai szabályozó hálózatnak. A fehérjéket kódoló ún. hírvivő (messenger) RNS-eken kívül, számos, már önmagukban is szabályozó funkcióval rendelkező RNS molekula került az utóbbi években azonosításra (mikroRNS-ek, hosszú nem-kódoló RNS-ek). Ezek között is bőségesen előfordult olyan, melyek mennyisége ösztrogén függőnek bizonyult.

Egy-egy pont egy átírt elem kifejeződésének erősségét mutatja. Bal oldalt a csökkent erősségű elemek, jobb oldalt az erősödött kifejeződásű elemek találhatók, A kék területen azok az elemek tallhatók melyeknek mennyisége nem változott jelentősen.

A cikkben részletes elemzés szól arról, hogy a több mint 2000 megváltozott átíródó elem milyen funkciócsoportokba tartozó fehérjéket kódol, illetve milyen szabályozó rendszerekhez tartozik. A kisspeptin sejtekben az ivari ciklus során megváltozik számos ingerület-átvivő anyag receptorának mennyisége, különböző más receptor típus mennyisége, a sejtek anyagfelvételéhez és leadásához szükséges szállítómolekulák (transzporterek) mennyisége, sőt még a sejtek anyagcseréjében elengedhetetlen szerepet betöltő mitokondriumok fehérjéinek mennyisége is. A megváltozott átíródó elemek számottevő része transzkripciós faktor, azaz ezek maguk is majd további genetikai elemek kifejeződését változtatják meg.

A kissppetin sejtekben ösztrogén hatásra az ingerületátvivő anyagokban és azok receptoraiban bekövetkező változások összefüggései.

No de mindettől mennyivel lettünk okosabbak? Megtudtuk, hogy milyen módon érzékelik a külvilágot a kisspeptin sejtek (milyen receptoraik vannak), illetve hogyan reagálnak (milyen működő fehérjéik vannak) az ivari ciklus eltérő fázisaiban. Az azonosított gének között számos olyat találtak, melyek mutációja az orvosi szakirodalom szerint a pubertás és a termékenység zavarait okozza. Ennek alapján feltételezhető, hogy a tanulmányban leírt további gének is fontosak lehetnek a fenti zavarokban, ezért új kutatási és gyógyítási irányokat jelölhetnek ki. Ezenkívül fontos adalékokkal járulnak hozzá a menopauzát (a női nemi ciklus és a menstruáció leállása) követő, csontritkulást és további tüneteket kiváltó ösztrogénhiány kialakulásának megértéséhez és lehetséges gyógyítási irányok kereséséhez.