Egy bolhapatkolós, kézügyességet igénylő lépéssel folytattuk. Az üvegekben úszó metszeteket a szeletek elkészültének (agyban elfoglalt helyzetük) sorrendjébe tárgylemezre kell helyezni. Ehhez a metszeteket Petri csészébe öntöttük, melyben kicsit viszkózus, száradáskor ragadós zselatin oldat volt. Itt először, finom ecsetekkel, az egér agy anatómiai atlaszát használva, megfelelő sorrendbe terelgettük a metszeteket, majd sorrendben felhúztuk a tárgylemezekre. Ez nehezebb, mint hangzik. A metszetek 100 mikron vastagok, nem szabad elszakadniuk és meggyűrődniük. A tudóspalánták ügyesek voltak, mind az atlasz olvasásában mind a szeletek pásztorkodásában, jó sorrendben terültek egymás mellé a metszetek.
Ahhoz, hogy mikroszkóp alatt is megnézhessük a metszeteket először még finom melegítéssel a tárgylemezre kellett szárítani őket, majd amikor ez megvolt egy speciális lefedő anyaggal fedőlemezt kellett rájuk ragasztani. Az anyagnak két szerepe van. Egyrészt ragasztóként körbeveszi a biológiai mintát és megvédi a baktériumoktól, illetve a fizikai sérüléstől (ettől fogva mintáink praktikusan örök életűek). Másrészt sajnos a fluoreszcens festékeknek megvan az a rossz tulajdonságuk, hogy amikor erős UV fénnyel megvilágítják őket, a magasabb energiaállapotba került festékmolekulák oxigénnel és egyébszabadgyökökkel reakcióba lépnek, melynek során elvesztik fluoreszkáló képességüket. A jelenséget quenching-nek, magyarul kioltásnak nevezik és hatására a minták egy idő után elvesztik a jelet. Megfelelő anyagokkal a quenching jelentősen csökkenthető, mert vagy elzárják a szabadgyököket, vagy segítenek a molekulának károsodás nélkül visszatérni az alacsonyabb energiaszintre.
Miután lefedtük a metszeteket és egy napot kötött a lefedőanyag, gyorsan meg is néztük egy viszonylag egyszerű fluoreszcens mikroszkópban. Néhány éve még az egész elemzést egy ilyen jószágon végeztük. De a technika fejlődésével Intézetünk mikroszkópos központjában már olyan mikroszkópok is találhatók, melyekbe egyszerre 12 tárgylemez tölthető és megfelelő beállítás után ezeket automatikusan bescanneli. A metszetek ezen digitalizált képét egy nagy filében (1-2GB) azután már arra a számítógépre visszük amelyikre szeretnénk és egy elemző program segítségével később is elemezhetőek eredményeink.

Mit is láttunk elsőre a gyors vizsgálattal (képek a bejegyzés végén a galériában). Először is, hogy PV és GlyT2 állatok festetlen metszeteiben is jól látható sejt, dendrit és axonfelhő jelöléseket kaptunk. A kettősfestésekben is kaptunk jeleket, mind a zöld, mind a piros csatornán. Nem feltétlenül volt életem legszebb immunfestése, de a képfeldolgozó programok csodákra képesek (ugye mivel nem festés mennyiséget, hanem jelenlétet nézünk, korrekt eljárás a jelszinteket igazítani).

A következő részben elemezzük majd azt, hogy a valós és a várt jelek eloszlását hogyan vizsgáljuk és mennyire fed át, mit tudtunk meg a kísérletből.

Szerző: Gulyás Attila